重组DNA与遗传工程

The Flow of Genetic Ination DNARNAProtein Translation Transcription Reverse Transcription DNA Replication RNA Replication DNA  DNADNA-dependent DNA Polymerase (DNA Replicase) DNA  RNADNA-dependent RNA Polymerase (Transcriptase) RNA  DNARNA-dependent DNA Polymerase (Reverse Transcriptase) RNA  RNARNA-dependent RNA Polymerase (RNA Replicase) DNA 合成酶、轉錄酶、反轉錄酶、 RNA 合成酶 The Central Dogma – 分子生物學的中心條教: 工程〔重遺傳組DNA) 重組DNA 技的件： 術條 1. 根本工具： enzymes 2. 基因的 源來: purified DNA or cDNA (complementary DNA) 3. 工具：傳輸transation, infection, electroporation, microinjection, gene gun 4. 技篩選術: specific antibody screening, hybridization (radioactive isotope or fluorescent agent label), 5. 基因表 ：現expression vectors, protein purification The toolkit for DNA technology: 1. Restriction enzymes 限制脢: Daniel Nathans, Hamilton Smith and Werner Arber (1978 Nobel Prize) 2. DNA vector 載體 3. Host organisms 宿主 Restriction enzymes 限制脢: 1.Daniel Nathans, Hamilton Smith and Werner Arber (1978 Nobel Prize), DNA ligase 黏合脢 互補DNA 的 造製 製備 cDNA 分 離 特 定 基 因 的 方 法 DNA vector： 載體 1. cloning vector 殖〔選載體Bacterial plasmids菌、細質體Bacteriophages 噬 菌 〕體 2. Shuttle vectors 穿梭〔用在酵母菌載體應 yeast 和 菌之上〕細 3. Retroviruses 反病毒〔藉由感染的方轉錄 式〕 大菌的腸桿質體 的放大質體圖 細 菌 間 質 體 基 因 的 轉 移 Host organisms 宿主 : (1) Bacteria: ：繁殖快速、容易操優點 作，缺：和控制真核胞點轉錄轉譯調機與細 不同 (2) Yeast: ：真核胞的控，缺優點細調 ：不易操作點 (3) Animal or plant cell: ：高等生優點 物胞的表，缺：不易接外細現點納來DNA 重組DNA 的方法 工程的用 遺傳應 一、 Diagnosis of Genetic Diseases疾遺傳 病的 診斷 二、 Human Gene Therapy 人基因類療 法 三、 Vaccines 疫苗 四、 Pharmaceutical products品造 藥製 五、 Forensic 法醫 六、 Environment 保環 七、 Agricultural 農業 GMO ：基因重 生物組 殖生基因的老鼠轉長 Agricultural 農業 Transgenic animals n enlarge valuable parts n resistant to pathagens n improved agricultural products, such as change AAs compositions Transgenic plants Ti plasmid (Tumor-inducing plasmid) Agrobacterium tumefaciens 根瘤土壤 菌桿 Antisense genes 反 基因義抑制番茄成熟 利用菌殖植物胞的方法細轉細 殖致瘤基因的植物轉 抗除草 基因的棉花劑 光草：殖作物螢煙轉 Human Gene Therapy 人基因法 類療 SCID (severe combined immunodeficiency) 重度混合免疫不全症 1. retroviral vector + ADA( 腺甘胺脫脢) T lymphocyte   intravenous injection 2. ADA gene bone marrow cell Diagnosis of Genetic Diseases 疾病的 遺傳診斷 Cystic fibrosis 囊性性纖維變 Huntington s disease 亨氏舞蹈症 聚合反脢連鎖應 -1 聚合反脢連鎖應 -2 Enzyme • Polymerase bind single stranded DNA at a point adjacent to a double-stranded stretch, and binds to dNTPs (deoxynucleotide triphosphates) Components of PCR reaction: Enzyme (Taq, Vent, Pfu) Appropriate buffers Ample dNTPs Template DNA Primers Cofactors (eg. Magnesium) The cycle 1 • Denaturation •94 or 92, 30 sec/incubation℃ • Half activity after 30 incubations at 94 ℃ for 60 sec each. • 60-120 sec for the first step The cycle 2 Annealing •Tm = 4 (GC bases) + 2 (AT bases) • 30-60 sec/incubation The cycle 3 • Extension •72, 500bp/30 sec; 500-1500/60 sec℃ Cycles Example: Denature Annealing Extension cycles 9445725 94557230-35 945572 (10 min) 1 Condition of temperature DNA 自定序動儀 DNA 自定序動儀 autosequencer 脂蛋白固醇與膽 HDLs: 高密度脂蛋白 將膽固醇運送到肝臟加以代謝 LDLs: 低密度脂蛋白 將膽固醇運