重组蛋白质表达、复性与纯化

重组蛋白质的重组蛋白质的 表达、复性与纯化表达、复性与纯化 为什么要重组基因表达？为什么要重组基因表达？ 1. 蛋白质功能研究蛋白质功能研究 2. 生物制药和疫苗生产生物制药和疫苗生产 3. 疾病的基因治疗疾病的基因治疗 4. 食品、化工用酶制剂食品、化工用酶制剂 5. 抗虫、抗逆植物改进 抗虫、抗逆植物改进 6. 细胞代谢产物的富集细胞代谢产物的富集 •基因表达体系及优劣势基因表达体系及优劣势 •大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系 •蛋白质的复性蛋白质的复性 •工作中经常碰到的问题工作中经常碰到的问题 基因表达体系基因表达体系 1. 原核体系原核体系 2. 真核体系真核体系 大肠杆菌 大肠杆菌 ( (Escherichia coli) ) • 遗传背景清楚，基因工程操遗传背景清楚，基因工程操 作方便，商品化表达载体种作方便，商品化表达载体种 类齐全，表达效率高；类齐全，表达效率高； • 根本不分泌，易形成包含体根本不分泌，易形成包含体 ( 无正确折叠的立体结构无正确折叠的立体结构 ) ，， 无加糖等修饰无加糖等修饰 枯草杆菌 枯草杆菌 (Bacillus subtilis) • 分泌蛋白质能力强，一般有天然分泌蛋白质能力强，一般有天然 立体结构；立体结构； • 无加糖修饰功能，培养液中蛋白无加糖修饰功能，培养液中蛋白 酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶 的水解；的水解； • 质粒不稳定，尚无商品化的表达质粒不稳定，尚无商品化的表达 载体载体 其 他其 他 •乳酸菌 乳酸菌 (Lactic acid bacteria) •沙门氏菌 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) •苏云金杆菌苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis) 真核细胞表达体系真核细胞表达体系 酵母细胞酵母细胞 昆虫细胞昆虫细胞 植物细胞植物细胞 / 组织组织 哺乳动物细胞哺乳动物细胞 / 组织组织 酵母细胞酵母细胞 • 可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，可生产分泌型蛋白；有天然立体结构， 有加糖修饰功能；可进行染色体整合型有加糖修饰功能；可进行染色体整合型 基因表达基因表达 ; • 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上 清多糖浓度高清多糖浓度高 ; • 商品化表达体系：商品化表达体系： • 酿酒酵母〔酿酒酵母〔 Saccharomyce cerevisiae 〕〕 ; • 毕氏酵母 毕氏酵母 (Pichia pastoris); • 裂殖酵母〔裂殖酵母〔 Schizosaccharom yce pombe 〕〕 昆虫细胞昆虫细胞 • 可以病毒感染的型式在成虫中生产可以病毒感染的型式在成虫中生产 ，也可在体外培养细胞中生产蛋白，也可在体外培养细胞中生产蛋白 ; • 适合分泌型和膜蛋白的表达，有加适合分泌型和膜蛋白的表达，有加 糖修饰；糖修饰； • 糖链有所区别，表达量有限；糖链有所区别，表达量有限； • 作为药物宿主细胞未被作为药物宿主细胞未被 FDA 认可认可 CHO 细胞细胞 • 可进行分泌表达，有天然可进行分泌表达，有天然 立体结构，加糖方式与人立体结构，加糖方式与人 体蛋白质完全一致；体蛋白质完全一致； • 表达量不够高，培养本钱表达量不够高，培养本钱 较高较高 植物组织植物组织 • 植物可大面积种植，可以廉植物可大面积种植，可以廉 价大规模生产；价大规模生产； • 转基因植物制作费时，表达转基因植物制作费时，表达 的组织特异性较难控制；的组织特异性较难控制； • 表达量较难提高，别离纯化表达量较难提高，别离纯化 不方便不方便 动物乳腺组织动物乳腺组织 • 分泌生产有天然立体结构和分泌生产有天然立体结构和 活性的蛋白质至乳汁，产量活性的蛋白质至乳汁，产量 高，别离纯化方便，特别适高，别离纯化方便，特别适 合药用蛋白的生产；合药用蛋白的生产； • 转基因动物制作花费巨大，转基因动物制作花费巨大， 实验周期长实验周期长 鸟类输卵管组织鸟类输卵管组织 •分泌生产有天然立体结构的分泌生产有天然立体结构的 蛋白质到蛋清，产量高，容蛋白质到蛋清，产量高，容 易贮存和运输，别离纯化方易贮存和运输，别离纯化方 便；便； •实验本钱低，饲养费用低；实验本钱低，饲养费用低； • 加糖方式可能与人有所不同加糖方式可能与人有所不同 体系选择体系选择 研究基因功能研究基因功能 : 大肠杆菌大肠杆菌 , 裂殖酵母裂殖酵母 , 昆虫细胞昆虫细胞 , CHO 细胞细胞 多肽药物生产多肽药物生产 : 大肠杆菌大肠杆菌 , 毕氏酵母毕氏酵母 , CHO 细胞细胞 , 乳乳 腺组织腺组织 疫苗疫苗 : 大肠杆菌大肠杆菌 , 酵母酵母 , 大多数沿用细胞培养产物进大多数沿用细胞培养产物进 行灭毒行灭毒 单抗生产单抗生产 : 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 工业酶生产工业酶生产 : 各种微生物 各种微生物 · 在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素   在大肠杆菌中生产人凝血 在大肠杆菌中生产人凝血 IX 因子因子   在大肠杆菌生产 在大肠杆菌生产 Calcitonin 类类 C 端酰胺化短肽端酰胺化短肽   在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰 在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰   在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化   在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化   提高乳腺分泌表达的 提高乳腺分泌表达的 Factor IX 类因子的活性类因子的活性   在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化 在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化 有可能以后能做到的事有可能以后能做到的事 在大肠杆菌中表达在大肠杆菌中表达 重组蛋白质重组蛋白质 •如果目的蛋白质有二硫键并需要如果目的蛋白质有二硫键并需要 正确的立体结构正确的立体结构 , 尽可能进行可尽可能进行可 溶性表达溶性表达 ; • 如果目的蛋白质没有二硫键或只如果目的蛋白质没有二硫键或只 用来制备抗血清用来制备抗血清 , 采用包含体表采用包含体表 达比较好达比较好 ; • 如果目的多肽的分子量小于 如果目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进行融合表达一定要进行融合表达 按蛋白质类型分按蛋白质类型分 • 单纯表达单纯表达 : pJLA 系列系列 , 用用 NcoI/NdeI 导入导入 AUG 的载的载 体体 • 融合表达融合表达 : 融合各种融合各种 tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc • 分泌表达分泌表达 : pel/ompT 分泌肽分泌肽 按启动子分按启动子分 • lac 及衍生的及衍生的 tac , trc, pac, rac 等启动子 等启动子 IPTG 诱导诱导 • lamda phage PL 和和 PR 启动子 启动子 热诱导 热诱导 • T7 启动子 启动子 IPTG 诱导诱导