重组DNA技术1概述

DNA 重组技术概述重组技术概述 天津科技大学：罗学刚天津科技大学：罗学刚 第一节 DNA 的重组的重组 DNA Recombination 基因表达的分子生物学根底基因表达的分子生物学根底 基因 蛋白质 机体构架功能效应生物催化 调控元件 mRNA 转录 翻译 生物性状生物过程 一个典型的原核细胞基因结构示意图一个典型的原核细胞基因结构示意图 原核细胞的基因是由成 百上千个核苷酸对组成 的。组成基因的核苷酸 序列可以分为不同区段。 在基因表达的过程中， 不同区段所起的作用并 不相同。有的区段能够 转录为相应的信使 RNA ，进而指导蛋白质 的合成，也就是说能够 编码蛋白质的区段叫做 编码区。有的区段不能 转录为信使 RNA ，也 就是说不能编码蛋白质 的区段叫做非编码区。 一个典型的真核细胞基因结构示意图一个典型的真核细胞基因结构示意图 真核细胞的基因是由编码 区和非编码区两局部组成 的。在非编码区上，同样 有调控作用的核苷酸序列 ，但是真核细胞的基因结 构要比原核细胞的基因结 构复杂。与原核细胞比较 ，真核细胞基因结构的主 要特点是：编码区是间隔 的、不连续的。也就是说 ，能够编码蛋白质的序列 被不能够编码蛋白质的序 列分隔开来，成为一种断 裂的形式。其中，能够编 码蛋白质的序列叫做外显 子，一般不能够编码蛋白 质的序列叫做内含子。 5’ 3’ 增强子增强子 CAAT 框框 TATA 框框 转录起始点转录起始点 外外 显显 子子 1 外外 显显 子子 2 外外 显显 子子 3 内内 含含 子子 1 内内 含含 子子 2 AATAAA 转录终止点转录终止点 真核细胞基因结构示意图真核细胞基因结构示意图 启动子：主要包括两个序列启动子：主要包括两个序列 〔〔 1 〕在〕在 5’ 端转录起始点上游约端转录起始点上游约 20~30 个核苷酸处有个核苷酸处有 TATA 框，框， 它是一个短的核苷酸序列，是启动子中的一个顺序，它是它是一个短的核苷酸序列，是启动子中的一个顺序，它是 RNA 聚合酶的重要接触点，能使酶准确识别转录的起始点并开始聚合酶的重要接触点，能使酶准确识别转录的起始点并开始 转录。当转录。当 TATA 框中的碱基顺序有所改变时，框中的碱基顺序有所改变时， mRNA 的转录就会的转录就会 从不正常的位置开始。从不正常的位置开始。 5’ 3’ 增强子增强子 CAAT 框框 TATA 框框 转录起始点转录起始点 外外 显显 子子 1 外外 显显 子子 2 外外 显显 子子 3 内内 含含 子子 1 内内 含含 子子 2 AATAAA 转录终止点转录终止点 真核细胞基因结构示意图真核细胞基因结构示意图 启动子：主要包括两个序列启动子：主要包括两个序列 〔〔 2 〕在〕在 5’ 端转录起始点上游约端转录起始点上游约 70~80 个核苷酸的地方，有个核苷酸的地方，有 CAAT 框，是启动子中另一个短的核苷酸序列，是框，是启动子中另一个短的核苷酸序列，是 RNA 聚合酶的聚合酶的 另一个结合点，它的作用还不肯定，一般认为它控制着转录的另一个结合点，它的作用还不肯定，一般认为它控制着转录的 起始频率，而不影响转录的起始点。当框中的碱基顺序改变后，起始频率，而不影响转录的起始点。当框中的碱基顺序改变后， mRNA 的形成量会明显减少。的形成量会明显减少。 5’ 3’ 增强子增强子 CAAT 框框 TATA 框框 转录起始点转录起始点 外外 显显 子子 1 外外 显显 子子 2 外外 显显 子子 3 内内 含含 子子 1 内内 含含 子子 2 AATAAA 转录终止点转录终止点 真核细胞基因结构示意图真核细胞基因结构示意图 增强子增强子：在 5’ 端转录起始点上游约 100 个核苷酸以远处的位 置，能使转录活性增强上百倍。 终止子终止子：在 3’ 端终止密码的下游有一个核苷酸顺序为 AATAAA ，， AATAAA 顺序和下游的反向重复顺序合称为终止子，是转录 终止的信号。终止子的特殊碱基排列顺序能够阻碍 RNA 聚合酶 的移动，并使其从 DNA 模板链上脱离下来。 反向重复顺序反向重复顺序 AUUU 5’ 5’3’ 3’ ATT AAAGGCTCC TTTT GGAGCCTTT TTTTT TAA TTTCCGAGG AAAA CCTCGGAAA AAAAA 模板链 转录 UU U U C C C C CG G G G G 3’5’ UU U UU A A A U U AU 某基因终止子的 反向重复顺序与 发卡结构的形成图解 D N A重组包括： 同源重组 细菌的基因转移与重组 位点特异重组 转座重组 接合作用 转化作用 转导作用 发生在同源序列间的重组称为同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination) ，又称根本重，又称根本重 组。是最根本的组。是最根本的 DNA 重组方式，通过链的重组方式，通过链的 断裂和再连接，在两个断裂和再连接，在两个 DNA 分子同源序列分子同源序列 间进行单链或双链片段的交换。 间进行单链或双链片段的交换。 以以 E.coli 的同源重组为例，了解同的同源重组为例，了解同 源重组机制的源重组机制的 Holliday 模型。模型。 一、同源重组一、同源重组 受体受体 四、转座重组四、转座重组 由插入序列和转座子介导由插入序列和转座子介导 的基因移位或重排称为转座的基因移位或重排称为转座 〔〔 transposition 〕。〕。 第二节 重组 D N A技术 D N A Recom bi nati on Techni que 基因工程诞生的历史背景： 1973年是基因工程诞生的元年。 1. 1944年 O sw al d T. A very等的肺炎球菌转 化证明了 D N A是遗传信息携带者。 2. 1953年 Jam es W atson和 Franci s Cri ck 两人提出了 D N A结构的双螺旋模型，揭示了 遗传物质自我复制的机制。 3. 1961-1965年 , 科学家破译了生物界全部 64个遗传密码 , 发表了划时代的遗传密码字 典，提出了遗传信息由 D N A →RN A → 蛋白质 传递的中心法那么。 4. 1970年发现了反转录酶，丰富了中心法 那么，为 cD N A的制备奠定了根底。 5. 染色体外 D N A ---- 质粒的深入研究，为第一 批重组 D N A载体提供了材料。 6. 1968-1970年，限制性内切酶的发现和纯化， 为 D N A的体外重组提供了有力的工具。 7. 1972年， Berg. D等人首次用限制性内切酶 EcoRI 切割噬菌体和 SV 40病毒 D N A分子，将这两 种不同来源的 D N A片段成功地在体外连接成杂合 D N A分子。 至此，用重组 D N A技术改变生物学性状的尝试 在 1973年由 Cohen等人完成。从此，这项技术 为生物学带来了一场深刻的革命，这类技术本身 也迅速地开展起来，并广泛地渗透到各个学科的 研究领域。 一、重组一、重组 DNA 技术相关概念技术相关概念 〔一〕〔一〕 DNA 克隆克