血球计数板

血球计数板 血球计数板被用以对人体内红、白血球进行显微计数之用，也常用于计算一些细菌、真菌、 酵母等微生物的数 量，是一种常见的生物学工具 1 含义 血球计数板血球计数板 用优质厚玻璃制成。每块计数 板由 H 形凹槽分为 2 个同样的计数池。计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高 0.10mm 的计数池。 计数池画有长、 宽各 3.0mm 的方格， 分为 9 个大方格， 每个大格面积为 1.0 毫米 X1.0 毫米=1.0 平方毫米;容积为 1.0 平方毫米 X0.1 毫米=0.1 立方毫米。其中，中央大方格用双线分成25 个中方格，位于正中及 四角 5 个中方格是红细胞计数区域（图中浅红色区域），每个中方格用单线划分为16 个小方格。四角的 4 个大方 格是白细胞计数区域（图中浅蓝色区域），每个大方格用单线划分为16 个中方格。根椐国际标准局（NBS）规定， 大方格每边长度允许误差为±1%。 说明：上图红色方框代表一个大方格；绿色方框代表一个中方格， 两种中方格的面积不一样大；蓝色方框代表 一个小方格。 2 基本构造 血球计数板是一块特制的厚型载玻片， 载玻片上有四个槽构成三个平台。 中间的平台较宽，其中间又被一短横 槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为 计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16 个中方格（大方格用三线隔开），而每个中方格又分成25 个 小方格；另一种是一个计数区分成25 个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16 个小方格。但 是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400 个小方格组成。 计数区边长为 1mm，则 计数区的面积为 lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数 区的体积为 0.1mm3，每个小方格的体积为 1/4000mm3。 使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品） 中微生物 细胞的数量。 3 使用方法 1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释100 倍），以每小格的菌数可数为度。 2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 3．将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过 多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可 以将菌悬液直接滴加在计数区上 （不要使计数区两边平台沾上菌悬液， 以免加盖盖玻片后， 造成计数区深度的升高） ， 然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。 4．静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在 低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照 的强度。 5．计数时若计数区是由16 个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的 4 个中方格（即100 小格）的菌数。如果是25 个中方格组成的计数区，除数上述四个中方格外，还需数中央1 个中方格的菌数（即80 个小格）。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规 定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左 线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见右图：即本格中计数细胞为3 个。 6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2-3 次（每 次数值不应相差过大，否则应重新操作），按公式计算出每mL（g）菌悬液所含细胞数量。 7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净 后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。 4 计数公式 红细胞数/L=N*25/5*10*10^6*200 N 为：五个中方格的RBC 总数 N/5 为：5 个中方格（粉红色区域）的平均RBC 数量（然后推及至中央大方格中每一个中方格 RBC 的数量） N*25/5 为：中央大方格 RBC 总数（即：0.1mm（ul）的 RBC 总数） N*25/5*10 为：1mm（ul）RBC 总数 N*25/5*10*10^6 为：1L 的 RBC 总数 *200 为血液的稀释倍数 公式简化后：红细胞数/L=N/100*10^12 公式前面部分都是换算成每微升血多少该计数细胞；最后都是由微升换算到升，乘以10 的 6 次方 (1)目镜测微尺每格长度=两个重叠刻度间物镜测微尺格数×10/两个重叠刻度间目镜测微尺格数 (2)以同样方法,分别在不同倍率的物镜下测定测微尺上每格的实际长度. (3)如此测定后的目镜测微尺的尺度,仅适用于测定时所用的显微镜的目镜和物镜的放大倍数.若更换物镜,目镜 的放大倍数时,必须再进行校正标定. 5 构造使用 血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台.中间的平台较 宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面,刻有一个方格网.方格网上刻有 9 个大方格,其中只有中间的一个大方 格为计数室,供微生物计数用.这一大方格的长和宽各为1mm,深度为 0.1mm,其体积为 0.1mm3. 计数室通常有两种规格.一种是大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格;另一种是大方格内分为25中格, 每一中格又分为 16 小格.但是不管计数室是哪一种构造;它们都有一个共同的特点,即每一大方格都是由 16×25=25×16=400 个小方格组成,见图. 6 使用说明 以计数酵母菌为例 (1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数. (2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有 4-5 个酵母细胞为宜,一般稀释 10 倍即可. (3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的厚玻片. (4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待 片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内. (5)计数时,如果使用 16 格×25 格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下 4 个中格(即 100 个小格) 的酵母菌数.如果规格为 25 格×16 格的计数板,除了取其 4 个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即 80 个小方格) 的酵母菌数. (6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上 的酵母细胞). (7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每 1ml 菌液中所含的酵母菌个数. 3.计算公式 (1)16 格×25 格的血球计数板计算公式: 酵母细胞数/ml=100 小格内酵母细胞个数/100×400×10 四次方×稀释倍数 (2)25 格 x16 格的血球计数板计算公式: 酵母细胞数/ml=80 小格内酵母细胞个数/80×400×10 四次方×稀释倍数 4.血球计数板