血球计数板

血球计数板 血球计数板被用以对人体内红、白血球进行显微计数之用，也常用于计算一些细菌、真菌、 酵母等微生物的数 量，是一种常见的生物学工具 1 含义 血球计数板血球计数板 用优质厚玻璃制成。每块计数 板由 H 形凹槽分为 2 个同样的计数池。计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高 0.10mm 的计数池。 计数池画有长、 宽各 3.0mm 的方格， 分为 9 个大方格， 每个大格面积为 1.0 毫米 X1.0 毫米1.0 平方毫米;容积为 1.0 平方毫米 X0.1 毫米0.1 立方毫米。其中，中央大方格用双线分成25 个中方格，位于正中及 四角 5 个中方格是红细胞计数区域（图中浅红色区域），每个中方格用单线划分为16 个小方格。四角的 4 个大方 格是白细胞计数区域（图中浅蓝色区域），每个大方格用单线划分为16 个中方格。根椐国际标准局（NBS）规定， 大方格每边长度允许误差为1。 说明上图红色方框代表一个大方格；绿色方框代表一个中方格， 两种中方格的面积不一样大；蓝色方框代表 一个小方格。 2 基本构造 血球计数板是一块特制的厚型载玻片， 载玻片上有四个槽构成三个平台。 中间的平台较宽，其中间又被一短横 槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为 计数区。计数区的刻度有两种一种是计数区分为16 个中方格（大方格用三线隔开），而每个中方格又分成25 个 小方格；另一种是一个计数区分成25 个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16 个小方格。但 是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400 个小方格组成。 计数区边长为 1mm，则 计数区的面积为 lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数 区的体积为 0.1mm3，每个小方格的体积为 1/4000mm3。 使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品） 中微生物 细胞的数量。 3 使用方法 1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释100 倍），以每小格的菌数可数为度。 2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 3．将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过 多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可 以将菌悬液直接滴加在计数区上 （不要使计数区两边平台沾上菌悬液， 以免加盖盖玻片后， 造成计数区深度的升高） ， 然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。 4．静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在 低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照 的强度。 5．计数时若计数区是由16 个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的 4 个中方格（即100 小格）的菌数。如果是25 个中方格组成的计数区，除数上述四个中方格外，还需数中央1 个中方格的菌数（即80 个小格）。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规 定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左 线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见右图即本格中计数细胞为3 个。 6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2-3 次（每 次数值不应相差过大，否则应重新操作），按公式计算出每mL（g）菌悬液所含细胞数量。 7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净 后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。 4 计数公式 红细胞数/LN*25/5*10*106*200 N 为五个中方格的RBC 总数 N/5 为5 个中方格（粉红色区域）的平均RBC 数量（然后推及至中央大方格中每一个中方格 RBC 的数量） N*25/5 为中央大方格 RBC 总数（即0.1mm（ul）的 RBC 总数） N*25/5*10 为1mm（ul）RBC 总数 N*25/5*10*106 为1L 的 RBC 总数 *200 为血液的稀释倍数 公式简化后红细胞数/LN/100*1012 公式前面部分都是换算成每微升血多少该计数细胞；最后都是由微升换算到升，乘以10 的 6 次方 1目镜测微尺每格长度两个重叠刻度间物镜测微尺格数10/两个重叠刻度间目镜测微尺格数 2以同样方法,分别在不同倍率的物镜下测定测微尺上每格的实际长度. 3如此测定后的目镜测微尺的尺度,仅适用于测定时所用的显微镜的目镜和物镜的放大倍数.若更换物镜,目镜 的放大倍数时,必须再进行校正标定. 5 构造使用 血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台.中间的平台较 宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面,刻有一个方格网.方格网上刻有 9 个大方格,其中只有中间的一个大方 格为计数室,供微生物计数用.这一大方格的长和宽各为1mm,深度为 0.1mm,其体积为 0.1mm3. 计数室通常有两种规格.一种是大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格;另一种是大方格内分为25中格, 每一中格又分为 16 小格.但是不管计数室是哪一种构造;它们都有一个共同的特点,即每一大方格都是由 16252516400 个小方格组成,见图. 6 使用说明 以计数酵母菌为例 1用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数. 2样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有 4-5 个酵母细胞为宜,一般稀释 10 倍即可. 3将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的厚玻片. 4将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待 片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内. 5计数时,如果使用 16 格25 格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下 4 个中格即 100 个小格 的酵母菌数.如果规格为 25 格16 格的计数板,除了取其 4 个对角方位外,还需再数中央的一个中格即 80 个小方格 的酵母菌数. 6当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞或只计数下方和左方线上 的酵母细胞. 7对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每 1ml 菌液中所含的酵母菌个数. 3.计算公式 116 格25 格的血球计数板计算公式 酵母细胞数/ml100 小格内酵母细胞个数/10040010 四次方稀释倍数 225 格 x16 格的血球计数板计算公式 酵母细胞数/ml80 小格内酵母细胞个数/8040010 四次方稀释倍数 4.血球计数板