铁皮石斛多糖与甘露糖检测规程
铁皮石斛多糖与甘露糖检测规程 铁皮石斛 Tiepishihu DENDROBII OFFICMALIS CAULIS 本品为兰科植物铁皮石斛Dendrobium officinale Kimu-ra et Mlgo的干燥茎。11月 至翌年3月采收,除去杂质,剪去部分须根,边加热边扭成螺旋形或弹簧状,烘干;或切成 段,干燥或低温烘干,前者习称“铁皮枫斗”(耳环石斛);后者习称“铁皮石斛”。 【性状】 铁皮枫斗 本品呈螺旋形或弹簧状.通常为2〜6个旋纹,茎拉直后长3. 5〜 8cm,直径0.2〜0.4cm。表面黄绿色或略带金黄色,有细纵皱纹,节明显,节上有时可见残 留的灰白色叶鞘;一端可见茎基部留下的短须根。质坚实,易折断,断面平坦,灰白色至灰 绿色,略角质状。气微,味淡,嚼之有黏性。 铁皮石斛本品呈圆柱形的段,长短不等。 【鉴别】(1)本品横切面:表皮细胞1列,扁平,外壁及侧壁稍增厚、微木化,外被 黄色角质层,有的外层可见无色的薄壁细胞组成的叶鞘层。基本薄壁组织细胞多角形,大小 相似,其问散在多数维管束,略排成4~5圈,维管束外韧型,外围排列有厚壁的纤维束, 有的外侧小型薄壁细胞中含有硅质块。含草酸钙针晶束的黏液细胞多见于近表皮处。 (2)取本品粉末lg,加甲醇50ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加水15ml 使溶解,用石油醍(60〜90°C)洗涤2次,每次20ml,弃去石油醍液,水液用乙酸乙酯洗涤2 次,每次20ml,弃去洗液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次20ml,合并正丁醇液, 蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取铁皮石斛对照药材lg,同法制成对 照药材溶液。照薄层色谱法(附录VIB)试验,吸取上述两种溶液各2〜5ul,分别点于同一 聚酰胺薄膜上,使成条状,以乙醇-丁酮-乙酰丙酮-水(15: 15: 5: 85)为展开剂,展开,取 出,烘干,喷以三氯化铝试液,在105°C烘约3分钟,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品 色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。 【检查】 甘露糖与葡萄糖峰面积比取葡萄糖对照品适量,精密称定,加水制成每 1ml含50pg的溶液,作为对照品溶液。精密吸取0. 4ml,按[含量测定]甘露糖项下方法依法 测定。供试品色谱中,甘露糖与葡萄糖的峰面积比应为2. 4〜8.0。 水分 不得过12. 0% (附录IX H第一法)o 总灰分 不得过6.0% (附录IX K) o 【浸出物】照醇溶性浸出物测定法(附录X A)项下的热浸法测定,用乙醇作溶剂, 不得少于6. 5% o 【含量测定】(一)多糖 1.1试剂 1. 1. 1 6%苯酚:先配置80%苯酚:80g苯酚(分析纯重蒸馅试剂)加20g水使之溶解,可置 冰箱中避光长期储存。 再配置5%苯酚: 取73ml80%苯酚于容量瓶中,加水至48g (每 次测定均需现配),测定的时候就用5%的苯酚来测! 1. 1.2无水乙醇 1. 1. 3 80%乙醇 1. 1. 4浓硫酸 1. 2设备: 1.2. 1 10ml具塞试管,试验前检查塞子的密封性,不得有泄漏, 1.2.2 10至15ml离心管,使管口离离心液液面1cm以上,以防离心液甩出。 1.2.3紫外一可见分光光度计 1.2.4冰箱与冰块 1.2.5粉碎机,耐酸薄手套。 2. 2对照品溶液的制备 2.2. 1)取无水葡萄糖对照品0. 1g,精密称定,加水制成每1ml含100 ug的溶液,即得。 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0. 8ml, 分别置10ml具塞试管中(用前注意检查塞子的密封性),各加水补至l.Onil,精密加入5% 苯酚溶液lml(临用配制),摇匀,再精密加硫酸5ml,摇匀,置沸水浴中加热20分钟,取出, 置冰浴中冷却5分钟,以相应试剂为空白,照紫外一可见分光光度法(附录VA),在488nm 的波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。20130723曲线 y=0. 0088x+0. 1128, y 为浓度.ug; x 为吸光度。 备注:1.检测液位浓稠硫酸样液,腐蚀性很强倒皿时一定小心不要弄到手上,最好带上 合适的手套。2.检测液为浓稠硫酸样液,且总体积只有7ml (共2皿),连续检测多个样品 时,比色皿用水洗净,尽量甩干,再用少量待测液润洗,待测样品放在冰水浴中,测一个拿 一个。3.试剂添加顺序:样品-5%苯酚-浓硫酸,不可颠倒;样品加浓硫酸前要摇匀,加 之后也要摇匀,注意塞子密封,小心漏液。4,用过的浓硫酸中会有炭丝,若检测液中 黑炭丝的颜色有扩散的话,0D值会升高,需重处理复测。 2.2.2供试品溶液的制备 鲜茎100g以上,剪成2-3mm段,105°C鼓风烘干,过40目筛分 别装入样品袋(鲜茎少的话,烘干后用锤子锤碎)称重,按筛上下重量比例取本品共约 0.3g,精密称定,加水200mL加热回流2小时,放冷,转移至250ml量瓶中,用少量水分 次洗涤容器,洗液并入同一量瓶中,加水至刻度,摇匀,滤过,精密量取续滤液2ml,置15ml 离心管中,精密加入无水乙醇10ml,摇匀,冷藏1小时,取出,离心(转速为每分钟4000 转)20分钟,弃去上清液(必要时滤过,观察上清液是否有沉淀,若有再离心或过滤),沉淀 加80%乙醇洗涤2次,每次8mL离心(转速为每分钟4000转)20分钟,弃去上清液,沉淀 加60-80度热水溶解,转移至25nil量瓶中,放冷,加水至刻度,摇匀,即得。 测定法 精密量取供试品溶液Ml,置10ml具塞试管中,照标准曲线制备项下的方法, 自“精密加入5%苯酚溶液1ml”起,依法测定吸光度A,从标准曲线上读出供试品溶液中 无水葡萄糖的量,计算,即得。多糖含量%= (A-0. 1124) /0. 0088*250*25/ (2*m* 1000000) *100 其中(A-0. 1124) /0. 0088 为检测液浓度 ug, 250*25/ (2*m)样品稀释倍数,1000000 为单位换算系数lg=1000000ugo 本品按干燥品计算,含铁皮石斛多糖以无水葡萄糖(C6H12O6)计,不得少于25.0%。 二)甘露糖 照高效液相色谱法(附录VI B)测定。 2. 1色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腊-0. 02mol / L 的乙酸铉溶液(20: 80)为流动相;检测波长为250nm。理论板数按甘露糖峰计算应不低于。 t000o 2. 2试剂 2. 2. 1盐酸氨基葡萄糖内标溶液12mg/ml 2. 2. 2 PMP(1-苯基-3-甲基-5-毗U坐d林酮)甲醇溶液0. 5mol/L 2. 2. 3 盐酸溶液 0. 3mol / L, 3mol/L 2. 2.4 氢氧化钠溶液 0. 3mol / L, 3mol/L 2. 3校正因子测定 取盐酸氨基葡萄糖适量,精密称定,加水制成每1ml含12mg的溶液, 作为内标溶液。另取甘露糖对照品约10mg,精密称定,置100ml量瓶中,精密加入内标溶 液1ml,加