cd59配体肽基因对卵巢癌细胞cd59表达的影响

CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响 作者：李伟伟高美华张落解西河 【摘要】目的研究CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影 响。方法构建CD59配体肽基因的真核表达重组体(CD59配体 pl RES),转染人卵巢癌细胞A2780, 818筛选稳定表达细胞克隆;RT PCR及悦stern bl ot方法检测细胞表面CD59 nRhA及蛋白的表达；MT 法测定细胞增殖抑制率。结果成功构建了 CD59配体肽基因真核表达 重组体，转染后的A2780 CD59 nRhA及蛋白的表达水平与W A2780 比较均明显下降(t=9. 21、7. 20, P 0. 05);细胞增殖抑制率明显增 高(F=5.417,q=3.93,P0.05)。结论CD59配体肽基因可影响人卵 巢癌细胞A2780表面CD59的表达，有望用于肿瘤治疗。 【关键词】抗原,CD59; A2780细胞;重组融合蛋白质类 [ABSTRACT] Cbj ecti ve To study the i nf I uence of CD59 I i gand pepti de on ovari an cancer cel I CD59. IVfet hods A eukaryot i c express! on recontoi nant of I i gand pepti de of CD59 was created and transfected i nto A2780 cel I s. Stabl e express! ve cel I cl one was screened by addi t i on of G418. The I eve I of CD59 nRI\A and protei n was detected by RT PCR; and cytostasi s rate detected by MT. Resul ts A eukaryoti c express! on recontoi nant of I i gand pepti de of CD59 was successful I y constructed. The express! ons of CD59 nRhkand protei n i ntransfected A2780 cel I s were I ower than that of W A2780 (t =9. 21, 7. 20; P 0. 05), and cytostasi srateobvi ousl yi ncreased (F=5.417, q=3. 93, P 0. 05). Cone I usi on CD59 Li gand pept i de can i nf I uence the express! on of CD59 nRIXk and protei n on the surface of A2780 cel I s, whi ch i s hope t o be used for one other a py. ［KEY VCRDS］ anti gens, CD59; A2780 cel I s; recontoi nant f usi on protei ns CD59是一种广泛分布于细胞膜表面的糖基磷脂酰肌醇锚固糖 蛋白，具有抑制补体效应的功能。首先，CD59以同源限制形式抑制 新生补体攻膜复合物(M\Q形成，保护自身正常组织细胞免遭补体溶 细胞损害［1］。其次，在多种生殖系统肿瘤细胞中发现CD59的过表达， 提示CD59可能与肿瘤细胞逃脱免疫监视相关。对CD59活性位点的研 究显示，Trp40对于CD59分子正常发挥生物活性具有重要作用［2］。 本科室利用噬菌体肽库筛选与CD59高效结合的短肽，并合成CD59配 体肽基因。实验结果显示，CD59配体肽基因可显著增强补体对肿瘤 细胞的溶解作用［3］，说明CD59配体肽基因可以结合并封闭正常CD59 分子的补体结合位点，具有中和正常CD59分子活性的作用。本研究 旨在进一步探讨CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响。现 将结果报告如下。 1材料和方法 1.1材料 1.1.1质粒、菌株与细胞株pIRES真核表达质粒、大肠杆菌 DFEa与人卵巢癌细胞A2780均由本教研室保存；PMJI8 Tvector由 大连TaKaRa公司生产。 1.1.2主要试剂PCR RT PCR所需引物由上海生物工程技 术服务有限公司生产；限制性内切酶EcoRI、Nne I、H nd m、T4 DI\A I i gase及PCR RT PCR检测试剂盒均购自大连TaKaRa公司；ECMKi t 由美国 Bost er 公司生产；Li pofecti n Reagen 2000 由美国 Invi trogen 公司生产。 1.2方法 1.2.1基因序列的获得 根据CD59配体肽氨基酸序列，得到完 整CD59配体肽基因序列。以其碱基序列为基础，设计2条单链，二 者互为引物，各含54个碱基且于3，端19位碱基处反向互补。行搭 桥PCR获得带酶切位点（EcoR I、Nne I）的CD59配体肽基因序列［4］。 1.2.2 CD59配体pl RES真核表达重组体的构建及鉴定CD59 配体肽基因的制备：以A B链互为模板引物行PCR反应。反应条件： 首先94 °C预变性2 niin;然后94。（：变性30 s , 46。（：退火1 niin , 68 °C延伸2niin, 5个循环;最后68。（：延伸5 nhi%取上述扩增产物 2 p L在30 g/ L的琼脂糖凝胶上进行电泳。CD59配体 pl RES真核 表达重组体构建及鉴定:sp dsD\A片段回收纯化，与Tvector 4 °C 过夜连接，连接产物TSS法转化感受态大肠杆菌眼a ,氨苯青霉素 及蓝白斑筛选，随机选取单克隆白斑菌落过夜摇菌，小提质粒。质粒 分别行PCR hhe I单酶切、N测序法鉴定CD59配体 pl RES 18T 阳性重组子。CD59配体 pIRES18T阳性重组子质粒行EcoRI、 Nnel双酶切，回收纯化外源基因片段。pIRES真核表达质粒的获得 与纯化与外源基因片段获得方法相同。外源基因片段与载体的连接、 连接产物的转化、阳性重组子质粒PCR及冲测序鉴定方法同sp 18T重组克隆载体。质粒EcoRI、hhe I双酶切后，取酶切产物5 p L在15 g/L的琼脂糖凝胶上电泳。 1.2.3人卵巢癌细胞A2780的转染及稳定转染细胞系的建立 参照《分子克隆实验指南（第3版）》中的方法进行转染,818压力筛 选建立稳定转染细胞系。CD59配体 pl RES重组质粒转染细胞命名 为CD59配体 A2780, pl RES空质粒转染细胞命名为VT A2780o 1.2.4 RT PCR方法检测转染细胞CD59配体肽基因的 表达采用BICZCL总RhA提取试剂分别提取CD59配体 A2780和 W A2780总R瓯鉴定CD59配体肽基因表达所用的上游引物为5 OTGrOTTGGCC