荧光原位杂交(FISH)实验步骤

仪器设备 1、 医用微波炉； 2、 水浴锅； 3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜； 4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。 FISH 试剂 （1）1×PBS：由 10×PBS 溶液稀释而成，储存于 4℃； （2）20×SSC（） ； （3）2×SSC，由 20×SSC 溶液稀释而成； （4）25mg/ml 蛋白酶 K 消化液。 （5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC， ：4ml 20×SSC；8ml 蒸馏水；28ml 甲酰胺。每次新鲜配制。 （6）杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml；蒸馏水 16ml；甲酰胺 20ml。每次新鲜配制。调节 pH 前升至室温。 实验步骤 1、脱蜡： 1）二甲苯脱蜡 3 次，每次 5min； 2）100％酒精两次，每次 2min； 3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。 2、蛋白酶处理: 1）每个染色缸40ml 蛋白酶 K 消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml 倒人 Facal 管，在水浴 槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。 2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶 K 溶液。37℃孵育 20min。 3） ×SSC 在室温下漂洗切片 3 次，每次 1min。 4）梯度酒精脱水（-20℃预冷） 。 3、变性： 1）每一个立式染色缸配制 40ml 变性溶液； 2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； 3）78℃孵育 8min； 4） 即移入-20℃预冷 70%酒精的染色缸内 2min，再依次移入 80%、90%和 100%的-20℃预 冷酒精内，每缸 2min； 5）空气干燥。 4、杂交： 1）准备探针； 2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片； 3）滴 10μl 探针在切片的组织上，加盖玻片； 4）盖上湿盒盖，37℃孵育 12h～16h。 杂交后的水洗： 5）镊子小心去除盖玻片； 6）43℃预热杂交后水洗溶液 40ml 水洗切片 15min； 7）2×SSC(37℃)洗两次，每次 10min； 8）切片放人染色缸的 1×PBS 内待检测，勿使切片干燥。 检测： 9）从 1×PBS 中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理 4 张切片。 10）每张切片使用 30μl～60μl 罗丹明抗-地高辛抗体或 FITC 卵白素，室温下孵育 20min； 11）去掉塑料盖膜，把切片放入含 1×PBS 的染色缸。1×PBS 室温下洗 3 次，每次 2min。 扩增： 12）从 1×PBS 中取出切片，斜置切片使液体排出； 13）每张切片滴 30μl～60μl 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育 20min； 14）去掉塑料盖膜，把切片放人含 1×PBS 的染色缸。1×PBS 室温下洗 3 次，每次 2min； 15）从 1×PBS 中取出切片，斜置切片使液体排出； 16）每张切片滴 30μl～60μl 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育 20min； 17）1×PBS 室温下洗 3 次，每次 2min。 5、细胞核染色： 1）张切片加 10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育 2～5ml； 2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后 1h 内可 以在显微镜下观察。 PRINS 步骤 1、常规脱蜡浸入 LPBS； 2、用 L 盐酸处理 5min； 3、蛋白酶 K(25μg/m1)消化 37℃ 15min； 4、分别用 80％，95％和 100％酒精脱水，室温干片； 5、加 PCR 混合液 25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，L MgCl2，各加 200μmol/L dATP， dCTP，dGTP，L dig-11-dUTP μl，引物 250ng，Taq DNA聚合酶 2U)，加盖片； 6、94℃变性 5min 后置入 65℃湿盒中 5min； 7、用×SSC 液，65℃洗 5min； 8、片于 65℃ 10s～20s；用 4×％吐温 20 液 42℃洗 5min，2 次； 9、经 Buffer I 液洗后滴加 20％羊血清封闭 30min； 10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下 2h； 11、BufferⅢ液洗 5min； 12、用 BCIP-NBT 显色 1h～2h，在镜下控制，终止显色； 13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。