FLT3基因突变与IL3受体α在急性髓系白血病的表达意义
FLT3基因突变与IL 3受体a在急性髓系 白血病的表达意义 作者:吴勇,陈景龙,骆社丹,陈元仲 【摘要】目的研究FLT3基因突变与IL 3受体a (IL 3Ra)在急性髓性细胞白血病(AML)的表达及临床意义。方 法采用RTPCR及限制性片段长度多态性(RFLP)分析检测 20例AML患者IL 3R a的表达水平及FLT3/ITD与D835突 变。结果20例中IL 3Ra高表达18例.FLT3/ITD突变7 例,D835突变1例,总突变率%,对照组未检测到FLT3/ITD突 变。高表达IL 3Ra与FLT3/ITD阳性患者外周血白细胞计 数高,白血病细胞比例高,完全缓解率低。结论IL 3Ra高表 达和FLT3基因突变均赋予急性髓系白血病细胞增殖优势,检 测两者水平对于评价AML患者疗效、估计预后具有重要意义。 【关键词】受体蛋白质酪氨酸激酶;串联重复序列; 突变;受体,白细胞介素3;白血病,粒细胞,急性 急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)是一种 涉及多基因遗传学改变的恶性血液病,其特征为细胞分化成 熟受阻,未分化细胞大量增殖。目前认为白血病幼稚细胞起 源于被称为白血病干细胞(leukemiast emcell,LSC)的细胞, 而LSC则被认为是由相应的正常细胞发生至少两次突变后形 成的异常产物。FLT3基因(FMS样酪氨酸激酶3.FMS 1 ike tyrosinekinase3)是II[型酪氨酸激酶家族成员的原癌 基因,FLT3基因突变是AML最常见的基因突变,主要包括内部 串联重复突变(internaltandemdupl ication, ITD)和 D835 突 变。IL 3受体是造血细胞因子受体超家族成员之一,IL 3受体Q亚基(I L 3Ra,又叫CD123)是白血病干细胞的特 异性标志,其蛋白表达产物CD123在LSC中高度表达,而在正 常的造血干细胞中不表达或表达很低[1]。本研究旨在探讨 两者与急性髓系白血病的疗效和预后的关系。 1材料与方法 临床资料 标本采集和单个核细胞(MNC)的制备 收集福建医科 大学附属协和医院血液科XX年3月一XX年6月住院的20例 急性髓系白血病患者外周血,年龄中位数35岁(32 + 3岁)。根 据FAB形态学分型,20例患者包括急性原粒细胞白血病未分 化型(Ml) 3例,急性原粒细胞白血病部分分化型(M2) 7例,急 性早幼粒细胞白血病(M3 )4例,急性单核细胞白血病(M5)6例, 外周血幼稚细胞均>60%,用淋巴细胞分离液密度梯度离心 分离外周血单个核细胞(MNC),用PBS液洗涤细胞2遍,-80°C 保存备用。同时采集4例正常人外周血单个核细胞为对照。 仪器与试剂Trizol试剂(美国GI BC0L公司),反转 录试剂盒(Omn iscriptRTkit,德国Qiagen公司),PCR试剂盒 (HotS tarTaq Mastermixki t,德国 Qiagen 公司),限制性内 切酶EcoRV(美国NewEngla ndBiolabs公司),琼脂糖(美国 AMRESCO 公司)。 细胞总R NA提取及cDNA合成 用Trizo 1试剂提取 细胞总RNA,在紫外分光光度计上读取总RNA的260nm、28 Onm 吸光度值(D),要求D260/D280>o用反转录试剂盒将上述样本 的总RNA反转录成cDNA,逆转录反应体系20uL,包括细胞总 RNA1 u g,10X 逆转录反应缓冲液 2uL,5 mmol/LdNTPs2 u L,10 u mol/LoligodT20 弓]物 2 uL,10U/ u LRNA 酶抑制剂 1 u L , 4U/ u L反转录酶1 u L,余用无核酸酶水补至20uLo在37°C 中反应6 0min,95°C反应5min灭活逆转录酶,-20°C保存备用。 RT P CR扩增IL 3R a mRNA的表达水平和FLT3 ITD突变 PCR采用HotStarPCR试剂盒,PCR反应体系25 uL: HotstarTaq Mastermix u L, cDNA u L , lOpmol/ u L 上、下游弓I 物各uL,余用水补至25uLoPCR反应条件:95°C预变性15min, 然后进入循环(94C变性30S-54C或61 °C退火45s-72C 延伸60s)共3 0循环,72C延伸10min°PCR所用的引物及PCR 产物的预期片段为: IL 3Ra : 上游:5 CTGTCTCCTGCAAACGAAGG3 下游:5 GTTGACGCCTGTTGGCAACG3 预期片段479b po FLT3/ITD: 上游:5 GGTGGTTGTCTCCTCTTCATTGTCG3 下游:5 TTTGACGGCAACCTGGATTG3 预期片段288bp,包含近膜(J M)区和激酶结构域的起始 部位,覆盖文献报道的大多数ITD所在的区域。 内参照人Bactin: 上游:5 CCTCGCCTTTGCCGATCC3 下游:5 GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC3, PCR产物的预期片段626bpo PCR产物用%琼脂糖凝胶电 泳分析结果。 RT PCR限制性片段长度多态性分析FL T3的D835 突变 FLT3氨基酸的D835突变,是由于mRNA2505突变A-G, 即GATATC-GATG TC,后者不能被EcoRV消化。为了检测FLT3 的D835突变,设计一条下游引物5 CCATCCACATTC TGATACATCGC3 ,上游引物同上,PCR反应体系和条件同上, 引物退火温度56°C,PCR产物的预期片段1235bp,覆盖了文献 报道的D83 5突变点。野生型FLT3RT PCR产物用EcoRV消 化后产生860bp和375bp片段,而突变型的FLT3 RT PCR产 物由于不能被EcoRV消化仍为1235bp片段。酶切反应体系 20UL,包括PCR产物10uL,10X反应缓冲液2 uL,10U/uL EcoRVl u L,余用无核酸酶水补至20 u Lo在37°C中反应 60min,酶切产物用%琼脂糖凝胶电泳分析结果。 2结果 IL 3R Q mRNA的表达水平 RT PCR检测发现20 例AML患者中18例IL 3R a mRN A的表达水平明显高于正 常(图1)。福建医科大学学报XX年5月 第42卷第3期 吴勇等: FLT3/ITD突变 RT PCR检测发现20例AM L患者细 胞FLT3mRNA的表达水平均高于正常。FLT3/ITD阳性7例, 突变率为35%,其中M12例,M22例,M31例,M52例。7例中有 2例为纯合子突变,5例为杂合子突变。4例对照组样本未检 测到FLT3/ITD突变。琼脂糖凝胶电泳显示,RT PC R扩增 产物正常在288bp处出现特异性条带,杂合子突变除上述条 带外,还出现一条或多条>288bp的特异性条带。纯合子突变 则只出现>288bp的条带(图2)o M: PCRMarker (NEB) ; 14:患者样本;5,6:正常人.A: