FLT3基因突变与IL3受体α在急性髓系白血病的表达意义

FLT3基因突变与IL 3受体a在急性髓系 白血病的表达意义 作者吴勇，陈景龙，骆社丹，陈元仲 【摘要】目的研究FLT3基因突变与IL 3受体a IL 3Ra在急性髓性细胞白血病AML的表达及临床意义。方 法采用RTPCR及限制性片段长度多态性RFLP分析检测 20例AML患者IL 3R a的表达水平及FLT3/ITD与D835突 变。结果20例中IL 3Ra高表达18例.FLT3/ITD突变7 例,D835突变1例，总突变率％，对照组未检测到FLT3/ITD突 变。高表达IL 3Ra与FLT3/ITD阳性患者外周血白细胞计 数高，白血病细胞比例高，完全缓解率低。结论IL 3Ra高表 达和FLT3基因突变均赋予急性髓系白血病细胞增殖优势，检 测两者水平对于评价AML患者疗效、估计预后具有重要意义。 【关键词】受体蛋白质酪氨酸激酶；串联重复序列； 突变；受体，白细胞介素3；白血病，粒细胞，急性 急性髓系白血病acutemyeloidleukemia,AML是一种 涉及多基因遗传学改变的恶性血液病，其特征为细胞分化成 熟受阻，未分化细胞大量增殖。目前认为白血病幼稚细胞起 源于被称为白血病干细胞leukemiast emcell,LSC的细胞， 而LSC则被认为是由相应的正常细胞发生至少两次突变后形 成的异常产物。FLT3基因FMS样酪氨酸激酶3.FMS 1 ike tyrosinekinase3是II［型酪氨酸激酶家族成员的原癌 基因,FLT3基因突变是AML最常见的基因突变，主要包括内部 串联重复突变internaltandemdupl ication, ITD和 D835 突 变。IL 3受体是造血细胞因子受体超家族成员之一，IL 3受体Q亚基I L 3Ra，又叫CD123是白血病干细胞的特 异性标志，其蛋白表达产物CD123在LSC中高度表达,而在正 常的造血干细胞中不表达或表达很低［1］。本研究旨在探讨 两者与急性髓系白血病的疗效和预后的关系。 1材料与方法 临床资料 标本采集和单个核细胞MNC的制备 收集福建医科 大学附属协和医院血液科XX年3月一XX年6月住院的20例 急性髓系白血病患者外周血，年龄中位数35岁32 3岁。根 据FAB形态学分型,20例患者包括急性原粒细胞白血病未分 化型Ml 3例，急性原粒细胞白血病部分分化型M2 7例，急 性早幼粒细胞白血病M3 4例，急性单核细胞白血病M56例, 外周血幼稚细胞均＞60,用淋巴细胞分离液密度梯度离心 分离外周血单个核细胞MNC,用PBS液洗涤细胞2遍,-80C 保存备用。同时采集4例正常人外周血单个核细胞为对照。 仪器与试剂Trizol试剂美国GI BC0L公司，反转 录试剂盒Omn iscriptRTkit,德国Qiagen公司,PCR试剂盒 HotS tarTaq Mastermixki t,德国 Qiagen 公司，限制性内 切酶EcoRV美国NewEngla ndBiolabs公司，琼脂糖美国 AMRESCO 公司）。 细胞总R NA提取及cDNA合成 用Trizo 1试剂提取 细胞总RNA,在紫外分光光度计上读取总RNA的260nm、28 Onm 吸光度值（D）,要求D260/D280o用反转录试剂盒将上述样本 的总RNA反转录成cDNA,逆转录反应体系20uL,包括细胞总 RNA1 u g,10X 逆转录反应缓冲液 2uL,5 mmol/LdNTPs2 u L,10 u mol/LoligodT20 弓］物 2 uL,10U/ u LRNA 酶抑制剂 1 u L , 4U/ u L反转录酶1 u L,余用无核酸酶水补至20uLo在37C 中反应6 0min,95C反应5min灭活逆转录酶,-20C保存备用。 RT P CR扩增IL 3R a mRNA的表达水平和FLT3 ITD突变 PCR采用HotStarPCR试剂盒,PCR反应体系25 uL HotstarTaq Mastermix u L, cDNA u L , lOpmol/ u L 上、下游弓I 物各uL,余用水补至25uLoPCR反应条件95C预变性15min, 然后进入循环（94C变性30S-54C或61 C退火45s-72C 延伸60s）共3 0循环，72C延伸10minPCR所用的引物及PCR 产物的预期片段为 IL 3Ra 上游5 CTGTCTCCTGCAAACGAAGG3 下游5 GTTGACGCCTGTTGGCAACG3 预期片段479b po FLT3/ITD 上游5 GGTGGTTGTCTCCTCTTCATTGTCG3 下游5 TTTGACGGCAACCTGGATTG3 预期片段288bp,包含近膜J M区和激酶结构域的起始 部位，覆盖文献报道的大多数ITD所在的区域。 内参照人Bactin 上游5 CCTCGCCTTTGCCGATCC3 下游5 GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC3， PCR产物的预期片段626bpo PCR产物用％琼脂糖凝胶电 泳分析结果。 RT PCR限制性片段长度多态性分析FL T3的D835 突变 FLT3氨基酸的D835突变，是由于mRNA2505突变A-G, 即GATATC-GATG TC,后者不能被EcoRV消化。为了检测FLT3 的D835突变，设计一条下游引物5 CCATCCACATTC TGATACATCGC3,上游引物同上,PCR反应体系和条件同上, 引物退火温度56C,PCR产物的预期片段1235bp,覆盖了文献 报道的D83 5突变点。野生型FLT3RT PCR产物用EcoRV消 化后产生860bp和375bp片段，而突变型的FLT3 RT PCR产 物由于不能被EcoRV消化仍为1235bp片段。酶切反应体系 20UL,包括PCR产物10uL,10X反应缓冲液2 uL,10U/uL EcoRVl u L,余用无核酸酶水补至20 u Lo在37C中反应 60min,酶切产物用％琼脂糖凝胶电泳分析结果。 2结果 IL 3R Q mRNA的表达水平 RT PCR检测发现20 例AML患者中18例IL 3R a mRN A的表达水平明显高于正 常（图1）。福建医科大学学报XX年5月 第42卷第3期 吴勇等 FLT3/ITD突变 RT PCR检测发现20例AM L患者细 胞FLT3mRNA的表达水平均高于正常。FLT3/ITD阳性7例， 突变率为35,其中M12例,M22例,M31例,M52例。7例中有 2例为纯合子突变，5例为杂合子突变。4例对照组样本未检 测到FLT3/ITD突变。琼脂糖凝胶电泳显示,RT PC R扩增 产物正常在288bp处出现特异性条带，杂合子突变除上述条 带外，还出现一条或多条＞288bp的特异性条带。纯合子突变 则只出现＞288bp的条带（图2）o M PCRMarker （NEB） ； 14患者样本；5,6正常人.A