SDS-PAGE检测重组蛋白试验

……………………………………………………………最新资料推荐………………………………………………… SDS-PAGESDS-PAGE检测重组蛋白检测重组蛋白一、实验目的一、实验目的 ① 掌握 SDS-PAGE的基本原理； ② 掌握 SDS-PAGE的凝胶制备方法； ③ 掌握蛋白质的考马斯亮蓝染色法； ④ 掌握测定重组蛋白分子量的方法。二、实验原理：二、实验原理： 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis），简称 PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。催化剂过硫酸铵（AP）可产生自由基，而加速剂四甲基乙二胺（ TEMED）可催化过硫酸铵加速自由基的产生，这样就可以形成丙烯酰胺长链，同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联，从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除的作用，在制备聚丙烯酰胺凝胶时通常要进行抽气，或者用水或正丁醇隔绝氧气。聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3~30%（V/V）之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3% （V/V）的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于 SDS-PAGE 的浓缩胶，也可以用于分离 DNA。高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10~20%（V/V）的凝胶常用于 SDS-PAGE的分离胶。聚丙烯酰胺凝胶具有以下突出的优点：（1）可以随意控制胶浓度和交联度，从而得到最新精品资料整理推荐，更新于二〇二一年一月三十日2021 年 1 月 30 日星期六 22:36:30 ……………………………………………………………最新资料推荐………………………………………………… 不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子；（2）能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度：10-9~10-12mol/L；（3）由于聚丙烯酰胺凝胶是由-C-C-键结合的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基-CO-NH2-，没有带电的其他离子基团，化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”；（4）由于可以制得高纯度的单体原料，因而电泳分离的重复性好；（5）透明度好，便于照相、扫描或复印。机械强度好，有弹性，不容易破碎，便于操作和保存；（6）无紫外吸收，不需染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析；（7）还可以用作固定化酶的惰性载体。聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质最初是在玻璃管中进行的，后来发展起来的垂直平板电泳一次最多可以容纳 20 多个样品，电泳过程中样品所处的条件比较一致，样品间可以进行更好的比较，重复性也更好，所以垂直平板电泳目前应用得最更为广泛，常用于蛋白质的分离和分子量的测定，以及DNA序列分析过程中的DNA片段的分离和鉴定。 2、SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是根据 SDS 和还原剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定 pH（碱性）缓冲体系中的分离。主要用于测定蛋白质亚基的分子量。与超速离心、凝胶过滤相比，SDS-PAGE 不需要昂贵的仪器设备，操作简便，能在几个小时内得到结果，有较高的重复性，且不需要非常纯的样品，是目前为大家所接受的用于测定亚基的分子量的一种最好的方法。这个方法可用于多肽分子量的分析，或用于变性蛋白的分离等。 SDS 是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构。强还原剂，如 β -巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入 SDS 和还原剂后，在 100℃加热 3~5 分钟，分子被解聚为组成它们的多肽链。解聚后的氨基酸侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。因此，结合了 SDS 的蛋白质可以在聚丙烯酰胺凝胶中向正极泳动，同时由于聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应，蛋白质在凝胶中的迁移率主要决定于自身分子量的大小，即分子量小的蛋白质分子通过凝胶孔的阻力小，迁移快，而分子量大的蛋白质分子通过凝胶孔的阻力大，迁移慢。 SDS-PAGE 分离不同蛋白质时的高分辨率，不仅是因为聚丙烯酰胺凝胶介质本身的特点，还归功于在电泳时采用了不连续系统。不连续系统对样品具有浓缩效应，从而提高了分离效果。（1）凝胶层的不连续。浓缩胶的孔径大，分离胶孔径小，在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小，移动快，而在小孔胶中移动慢。因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性，使样品迁移受阻，而压缩成很窄的区带。最新精品资料整理推荐，更新于二〇二一年一月三十日2021 年 1 月 30 日星期六 22:36:30 ……………………………………………………………最新资料推荐………………………………………………… （2）缓冲液离子成分及pH的不连续。在两层凝胶中均有Tris（三羟甲基氨基甲烷）及 HCl。Tris 的作用是维持溶液的电中性及 pH 值，是缓冲配对离子，HCl 在任何 pH 值溶液中均易解离出 Cl-（氯离子），它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的Gly（甘氨酸）在 pH6.8 的缓冲体系中解离度很小，仅0.1- 1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。蛋白质-SDS 复合物带有负电荷，在 pH6.8 的浓缩胶中，向正极泳动，迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当蛋白质进入 pH8.8 的分离胶中，Gly 的解离度增加，其迁移率就超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质由于分子量大，被留在后面，然后分成多个区带，因此浓缩胶与分离胶之间 pH 值的不连续性，能控制迁移率：在浓缩胶中，要求慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品在快慢界面之间被浓缩；进入分离胶后，慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。（3）电位梯度的不连续。电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关（V=mE）。电泳开始后，由于快离子迁移率大，就会很快超过蛋白质，在快离子后面形成一个离子浓度低的区域即低电导区，有较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子在快离子后面加速泳动。当三者的迁移率与电位梯度的乘积彼此相等时，三者的泳动速度就相等。在快慢离子的移动速度相等的稳态建立后，二者之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面，而蛋白质的有效迁移率在快慢离子之间，因此也就聚集在这个移动附近，被压缩成一个狭小的中间层。 3、蛋白质（亚基）分子量的测定蛋白质-SDS 胶束在水溶液中的形态，就像一个长椭圆棒，椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-