Pichia酵母表达系统使用心得资料

Pichia 酵母表达系统使用心得 摘要：? Pichia 酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。? 生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以 Invitrogen 公司的 Pichia 酵母表达系统最为人熟知， 并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基 因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用 EasySelect Pichia Expression System 这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中 Xiang Yang 是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi 癌症中心（Lombardi Cancer Center） ，部 分用户来自国内。 甲基酵母部分优点 与其他真核表达系统比较 与原核表达系统比较 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工， 有利于真核蛋白的表达优点 - + 2.AOX 强效启动子， 外源基因产物表达量高， 可以达到 每升数克表达产物的水平 +++ + 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物， 远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。 +++ = 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。 = + 5.可以甲醇代替 IPTG 作为诱导物，部分甲醇酵母更可 以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低 +++ + + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System 产品性能： 优点??使用简单，表达量高，His-tag 便于纯化 缺点??酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题 全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物， 因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基 中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体 pPICZ 在多克隆位点（MCR）3 端带有 his-tag 和 c-myc epitopes，这些 tag 有利于常规检 测和纯化，而且在 MCR5 端引入了 alpha factor（? -factor）用以增加表达，并且在表达后 ? -factor 可以自动被 切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是 EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另 外 pPICZ 系列选用的是 Zeocin 抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇??甲醇比一般用于大肠杆 菌表达诱导使用的 IPTG 便宜。 第一步? 构建载体? Xiang Yang：pPICZ 系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择 pPIC9K 还是 pPICZ 系列？pPIC9K 属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而 pPICZ 系列比 较容易操作，大肠和毕赤酵母均用 抗 Zeocin 筛选（PIC9K 操作麻烦一点，大肠用 amp 抗性，而毕赤酵母先用 His 缺陷筛选阳性克隆，在利用 G418 筛选多拷贝） ，而且对于大小合适（30?50KD）的蛋白在产量上是 pPIC9K 无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱） ，她和 大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的） ，因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度， 颜色以外， 也可以取样到显微镜中观测。 大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧， 表达过程中染菌 （我 们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历） ，如果在不知情的情况下继续做下去，那 可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境） ，生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是 应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有 100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是 为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌 pET 系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因 为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰） 。这样我的 DNA 片段由于较 长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是： ①酶切位点不能出现在目的 DNA 片段中??如果片段长无法避免，可以采用平末端连接； ②虽然 ? -factor 可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在 N 端不能出现任何多余的 aa（比如药物蛋白 表达） ，需要特别留意（说明书上有详细说明：P13） ； ③有三种不同的读码框 （对于 pPICZ?系列来说就是对上 ? -factor 序列） ， 在设计克隆的时候要反复确定自己的 读码框是否正确，这可是致命的问题； ④无论 pPICZ 还是 pPICZ?都有 TGA（终止密码子） ，但是 pPICZ 系列没有 ATG（起始密码子） ，有人认为酵母 启动子与外源基因的 ATG 之间的距离越短对于表达的该基因越有利； ⑤如果不希望有 c-myc 和 His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子； ⑥Pichia 的密码子与酿酒酵母的相似，有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换，有人认为一 定要换，个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子，而如果片段过长就比较麻烦，不过有许多 真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的； ⑦克隆菌株需要有 recA，endA，试剂盒带有的 TOP10 挺好用的（其它像是 DH5?都行） ，但是要注意带有筛 选抗生素 Zeocin 的培养基要用低盐培养基（NaCl 减半） ，这主要是因为怕影响到抗生素作用（Zeocin 平板要 避光保存） ； ⑧测序引物可以用 ? -factor 信号引物，也可以用 5 AOX1 引物； ⑨如果需要高量表达，可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达，另外也可以在转化酵母的时候重复转 化。 ⑩目的基因中最好不要含有 pro-glu-ser-thr 这样的序列，因为这个序列是激活蛋白水解酶的作用底物，会影响 表达，另外也不要含有 x-phe-x-arg-gln 和 gln-arg-x-phe-x 这样的序列（x=任何氨基酸） ，因为这些序列容易受到 容酶体的切割，而且目的蛋白末端最好是 ala,asp,val,ser 这样的氨基酸。除此之外许多高 A+T 含量的基因通常 会由于提前终止而不能有效转录，也需要多加注意。 第二步? 线性化的 DNA 转化入 Pichia 酵母? Xiang Yang：EasySelect 试剂盒准备了三种菌株：X33，GS115 和 KM71H。我倾向于选择 X33，因为这个菌株转 化率和表达量相对而言较高，如果你有电转仪（electroporator） ，可以尝试一下。如果没有的话，EasySelect 也准备了化学转化试剂??EasyComp Transation，但是由于转化率的缘故，我建议使用电转仪。 leslie：在得到了正确的序