NK细胞培养SOP

第 1 页 NK 细胞制备与培养标准操作流程 1 目的与范围： 1.1 目的： 规范 NK 细胞培养操作流程， 保证 NK 细胞产品制备的稳 定性、均一性。 1.2 范围：适用于本实验室细胞培养技术人员对 NK 细胞培养的全 过程。 2 文件： 2.1 NK 细胞制备与培养标准操作流程 3 记录： 3.1 NK 细胞制备与培养记录表、操作 1 间清场记录表 4 试剂、耗材与仪器设备： 4.1 试剂：75%酒精、D-PBS 缓冲液或生理盐水、淋巴细胞分离 液、AMMS 无血清培养基、自体血清、A/B/C/D/E 因子、IL- 2。 4.2 耗材： T175 培养瓶、 1.5L 培养袋、 15ml 离心管、 50ml 离心管、 50ml 一次性注射器、5ml 一次性注射器、1ml 一次性注射器、 10ml 移液管、 1ml 枪头、 200ul 枪头、 10ul 枪头、 巴斯德滴管、 0.2ml Ep 管、0.22um 一次性过滤器。 4.3 仪器设备：超净工作台、离心机、倒置显微镜、CO2培养箱、 第 2 页 水浴锅、电动移液枪、1ml 手动移液枪、200ul 手动移液枪、医 用剪刀、医用止血钳、试管架、50ml 注射器支架、托盘。 5 工作程序： 5.1 实验前准备： 5.1.1 洁净区需经紫外线照射， 连续照射时间≥30min， 实验室共 作过程中风机始终保持开启运行状态。 5.1.2 超净工作台需经过开机紫外线照射， 照射时间≥30min， 开 机风机运行≥10min。开启超净工作台玻璃防护窗，待超净 工作台内部气流稳定后才可使用。 5.1.3 将实验室所需的器械、耗材放于物料传递窗进行紫外线照 射≥30min （器械与各规格的移液枪头必须经过高温高压灭 菌锅消毒灭菌，且在合格期内），照射完毕后将器械包与 所需耗材用 75%酒精纱布擦拭外包装消毒后放入超净工作 台内备用。 5.1.4 将淋巴细胞分离液、AMMS 无血清培养基、PBS 缓冲液或 生理盐水提前 30min 从 4℃冰箱取出，用 75%酒精纱布擦 拭后放入超净工作台，恢复至室温备用。 5.1.5 A/B/C/D/E 因子、IL-2 在使用时提前 10min 从-20℃冰箱取 出，即用即取，禁止在常温状态下长期放置。 5.1.6 将所需 T175 培养瓶、50ml 离心管、15ml 离心管、50ml 一 次性注射器、10ml 移液管、1ml 移液枪头、200ul 移液枪头 经过酒精擦拭后放入超净工作台备用。 第 3 页 5.2 试剂配制： 5.2.1 配制要求：实验室所有试剂配制应在超净工作台内，按照 试剂说明书或按照实验室细胞培养要求配制试剂。 5.2.2 NK 细胞培养基配制： 5.2.2.1 完全培养基：AMMS 无血清培养基+5%自体血清 5.2.2.2 活化培养基：AMMS 无血清培养基+IL-2（终浓度为 1000IU/ml） 5.2.3 细胞因子配制：将因子 B/C/D/E 从 4℃冰箱取出，打开后， 用 1ml 移液枪注入 1ml 活化培养基使其充分溶解后吸出备 用，再用 1ml 培养基冲洗西林瓶，以减少最大损耗。 5.3 T175 培养瓶包被预处理（第-1 天） 5.3.1 用移液枪将 NK 试剂 A 全部转移到事先备有的装有 12.5ml D-PBS 的 15mL 离心管中，充分混匀 30s-1min 后将溶液全 部转移入 T175 培养瓶中，轻轻摇晃使其均匀铺满底部， 4℃冰箱平放过夜。（注意：第一次吸取试剂 A 原液后， 可再用适量 PBS 冲洗西林瓶洗出残留原液， 以最大程度减 少损耗） 5.3.2 24h 后取出，直接吸弃包被液，无需清洗即可使用。 6 分离提取 PBMC（第 0 天）： 6.1 制备血浆： 6.1.1 将装有全血的采血管用酒精擦拭外表面消毒后放入超净工 作台内， 打开采血管盖子， 将全血倒入至事先备好的 50ml 第 4 页 离心管中，一共 2 支，每管 25ml。 6.1.2 室温 2000rpm，离心 10min（离心机升降速：升 9 降 4）。 6.1.3 离心完毕后，从离心机中拿出离心管，用 75%酒精纱布擦 拭离心管外表面消毒，放入超净工作台内，用电动移液枪 吸取上层血清至 50ml 离心管中，灭活（56℃水浴锅中水浴 30min，4℃放置 30min），剩余下层血细胞备用。 6.1.4 将灭活好的血清 2800rpm 离心 8min，离心完毕后，将上清 分于 3 支 15ml 离心管中，-20℃冰箱保存。 6.2 提取 PBMC： 6.2.1 将生理盐水袋用 75%酒精纱布擦拭消毒后放入超净工作台 内，再用 75%酒精纱布对生理盐水袋口进行擦拭消毒后， 用医用剪刀剪去袋口。 6.2.2 用生理盐水对 6.1.3 剩余的下层血细胞进行稀释， 稀释比例 按生理盐水:血细胞=1.5:1， 最后将稀释好的血细胞重悬、 混 匀备用。 6.2.3 根据稀释后的血细胞体积， 在另一个 50ml 离心管加入对应 体积的淋巴细胞分离液，将稀释、混匀的血细胞悬液缓慢 加入到装有淋巴细胞细胞分离液的 50ml 离心管中 （即淋巴 细胞分离液:稀释的血细胞悬液=1:1）。 6.2.3.1 操作方法：可将离心管倾斜 45°，用电动移液枪吸取 血细胞悬液， 沿离心管壁缓慢滴加在淋巴细胞细胞分离 液表面，滴加完毕后，缓慢竖立离心管（不要打乱液面 第 5 页 界面），加入总体积不超过 45ml，室温，2500rpm，离 心 20min（注意：调整离心机的升降速为最低，调整电 动移液枪输出速度最低）。 6.2.4 离心完毕后，小心取出离心管，可见清晰的细胞分层，用 75%酒精纱布擦拭离心管外表面消毒后放入超净工作台。 （注意轻拿轻放，保持离心管竖直放置，以免破坏细胞分 层）。 6.2.5 用巴斯德滴管或 1ml 移液枪缓慢插入离心管中，沿管壁提 取淋巴细胞分离液与血浆层交界处的白膜层，将提取的白 膜层细胞加入到备用的 50ml 离心管中，补充生理盐水至 45ml，混匀，1500rpm，离心 5min。 6.2.6 离心完毕后，取出离心管，用酒精纱布擦拭离心管外表面 后放入超净工作台内，倒掉上清，补充生理盐水至 45ml 重 悬，1000rpm，离心 10min（步骤 6.2.6 重复两次）。 6.2.7 待步骤6.2.6第二次离心完毕后， 取出离心管， 外表面用75% 酒精纱布擦拭消毒后放入超净工作台内，取足量上清至 15m 离心管中，做上标记 ，送微生物检测并留样（检测内 容：细菌、霉菌、内毒素、衣原体、支原体），剩余上清弃 去， 离心管底部剩余细胞用 10mL 活化培养基重悬， 计数。 6.3 细胞接种： 6.3.1 根据计数结果将细胞浓度调整为 1-2×106个/mL（最优为 1.5×106个/mL），用适量活化培养基冲洗离心管并转移入 第 6 页 T175 包被培养瓶中，以减少细胞损耗。（注意：包被瓶取 出时间为细胞加入前 5min，其他时间需在 4℃放置保存） 6.3.2 并补加 NK 试剂 B，患者灭活血浆 1.25mL（5%）确保瓶中 培养基终体积为 25mL 左右，拧紧培养瓶盖，“8