质粒DNA的分离、纯化和电泳检测

分分子子生生物物学学实实验验报报告告 质粒质粒 DNADNA 的分离、纯化和电泳检测的分离、纯化和电泳检测 姓姓名名：： 班班级级：： 学学号号：： 指指导导老老师师：： 同同组组者者：： 年月日年月日 分子生物学实验报告 摘要摘要 提取和纯化质粒 DNA 的方法很多，其中碱变性提取法最为经典和常用，适 于不同量质粒 DNA 的提取。该方法操作简单，易于操作，且提取质粒 DNA 纯度 高，一般实验室均可进行。该方法利用染色体 DNA 与质粒 DNA 变性与复性所依 赖的溶液 pH 值不同来将染色体 DNA 沉淀，再经过一系列除杂的方法除去 RNA 及 其它蛋白质杂质从而得到质粒 DNA。而琼脂糖凝胶电泳是一种常用的纯化和检 测 DNA 的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极 移动。样品 DNA 分子的大小、DNA 分子的构象影响 DNA 的移动速度从而将不同 分子大小与构象的 DNA 分子分离开来。 关键词：碱变性法；质粒关键词：碱变性法；质粒 DNADNA；凝胶电泳；凝胶电泳 1 1．原理与方法．原理与方法 1.11.1 质粒载体质粒载体 质粒是存在于细菌染色体外的一个或多个双链闭合环状小分子 DNA，其大 小从 1kb 至 200kb 以上不等。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细 胞的染色体之外，质粒 DNA 上携带了部分的遗传信息，控制细菌某些特定的遗 传性状，如性菌毛形成、形成耐药性、产生细菌素、抗生素等。通常情况下可 持续稳定地复制，但在一定条件下也可可逆地整合到寄主染色体上，随着染色 体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒还可通过接合或转导的方 式在细菌间传递。 质粒由于分子小、便于分离和提取，在 DNA 重组中，质粒或经过改造后的 质粒可通过连接外源基因构成重组体，携带目的基因进入细菌、动物细胞或植 物体内进行扩增与表达，因此是基因工程中一种非常重要的载体，质粒特征的 分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。近年来由于基 因芯片技术的出现，质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展，所以这 就要求我们从宿主细胞中提取高质量的质粒 DNA，质粒提取成为分子生物学实 验室一项最基本的工作。 1.21.2 碱变性提取法提取质粒碱变性提取法提取质粒 提取和纯化质粒 DNA 的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、 羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和 Wizard 法等。其中，碱变 1 分子生物学实验报告 性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒 DNA 的提取。该方法操作简单，易 于操作，一般实验室均可进行。提取质粒 DNA 纯度高，可直接用于酶切、序列 测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体 DNA 相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒 DNA 多为超 螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒 DNA 还可 用沸水浴法、Wizard 法等，沸水浴法提取的质粒 DNA 中常含有 RNA，但不影响 限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。 碱变性提取质粒 DNA 一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒； 收集和裂解细胞；分离和纯化质粒 DNA。 在细菌细胞中，染色体 DNA 和质粒 DNA 均被释放出来，但是两者变性与复 性所依赖的溶 pH 值不同。在 pH 值高达 12.0 的碱性溶液中，染色体 DNA 的氢键 断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒 DNA 的大部分氢键断裂，但 两条互补链不完全分离。因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。当用 pH 值 4.6 的 KAc（NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒 DNA 可恢复原来的共 价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体 DNA 不能复性，而是与不稳 定的大分子 RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。 这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒 DNA 分离。溶于上清液的质粒 DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于 DNA 和 RNA 性质类似， 乙醇沉淀 DNA 的同时，也伴随着 RNA 沉淀，可利用 RNaseA 将 RNA 降解。质粒 DNA 溶液中的 RNaseA 以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获 得纯度较高的质粒 DNA。 1.31.3 凝胶电泳法进行凝胶电泳法进行 DNADNA的分离纯化的分离纯化 电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向 移动的现象。各种生物大分子在一定 pH 条件下，可以解离成带电荷的离子，在 电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有 电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的 大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小 不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化 DNA 片段，是分子生物 学的核心技术之一。 凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。此外，凝胶中 DNA 的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(ethidium bromide，EB)或 SYBR Gold 染色直接观察到，甚至含量少至 20pg 的双链 DNA 在紫外激发下也能 直接检测到。需要的话，这些分离的 DNA 条带可以从凝胶中回收，用于各种各 样目的的实验。 2 分子生物学实验报告 分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺凝胶。这 两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行 电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸(5—500bp)的分离和蛋 白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差 1bp 或质量上相差 0.1%的 DNA 都可 以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 DNA 序列分析的分子基础。 虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的 DNA 上样量，但是与琼脂糖凝胶相 比，在制备和操作上繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由 β -D- 吡喃半乳糖与 3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为 104-105。琼脂糖 加热至 90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝 胶，其凝固点为 40-45℃。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它 的分离范围更大(50 至百万 bp)，小片段 DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和 方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作， 适用于核酸电泳，测定 DNA 的相对分子质量，分离经限制酶水解的 DNA 片段， 进一步纯化 DNA 等。 琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有 负电荷，在电场中向正极移动。DNA 在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于 6 个因素：样品 DNA 分子的大小、DNA 分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、 缓冲液和温度。 本实验中影响 DNA 在琼脂糖凝胶中电泳迁移率的主要是所提取样品 DNA 分 子的大小和分子构象。其