细胞培养标准操作程序SOP

细胞培养标准操作程序（（SOPSOP）） 1 1．目的．目的： 为了保证培养细胞的正常生长， 实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤， 特制订 实验室细胞培养操作流程。 2 2．适用范围：．适用范围： 适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。 3 3．操作规程：．操作规程： 培养液、培养液、PBSPBS、胰蛋白酶的配制、胰蛋白酶的配制 1000ml 1000ml 培养液的配制培养液的配制 1、准备用品：培养粉、1000ml 烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH 仪、2～3 天内的新鲜三蒸水 （或新鲜反渗水）、NaHCO3 粉、1000ml 无菌玻璃瓶（100ml×10 个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3 个过 滤器、注射器。紫外线照台 30min。 2、将培养粉用 900ml 新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。 3、充分搅拌，按说明添加成分（如 Invitrogen 公司的 RPMI-1640 配制 1000ml 需加 NaHCO3 粉， Invitrogen公司的 DMEM 需加 NaHCO3 粉等），再充分搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。 4、用 1M（1mol/L）HCl调 PH 至左右（细胞适宜在～生长，配制好后 PH 值会升高～，故配时调 PH 至左右）。 5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到 1000ml。 6、配青霉素80 万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解 配链霉素 100 万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解 取青霉素和链霉素加入到 1000ml 培养液中，使其终浓度均为 100U/ml，充分搅拌混匀。 7、在无菌操作台里用的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到 100ml 玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄 膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。 注意：注意： （1）配制培养液及调节培养液 PH 值所使用的 HCl 和（或）NaOH 均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。 一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。 （2）准备的准备的 100ml×10100ml×10 个玻璃瓶必须事先高压灭菌个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗 水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。 PBSPBS（平衡盐溶液）的配制（平衡盐溶液）的配制 NaCl8g KCl＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至 1000ml Na2HPO4*H2O KH2PO4 （1）无需调 PH 值，其成分溶解后 PH 为，不需除菌滤膜过滤除菌，放于 4℃保存，用前直接高压灭菌 （高压时，装 PBS 的瓶子的瓶盖要插针头!） （2）Na2HPO4*H2O则 Na2HPO4*12 H2O 需 （3）如欲配制 500ml，以上成分减半即可 % %胰蛋白酶的配制胰蛋白酶的配制 胰蛋白酶粉 EDTA（乙二胺四乙酸二钠） NaCl KCl ` +新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至 1000ML NaHCO3 Glucose(葡萄糖) 酚红 （1）配出来的 PH 值为，在 PH 值～范围内，故不需调 PH 值。 （2）用的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20℃保存备用。4℃可连续使用 1 月左右。 （3）用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器 均不需高压灭菌，干净即可。 （4）如欲配制 500ml，以上成分减半即可 细胞复苏细胞复苏 1、准备：紫外线照台 30min，准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培养基临用前 放水浴箱里温育 20 分钟。在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等，右 边放滴管架、镊子，右上角放废液缸。 2、灼烧培养瓶口及瓶盖，用滴管取培养基 5ml 加入试管中（一滴约为 50ul）。 3、戴手套，从-196℃液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻 存管，保证冻存管内细胞 1min1min 内融化。以 70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（慢冻快融慢冻快融） 4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培养基的试管中，塞子塞试管， 800rpm 离心 2min（用培养基且离心的目的:去除细胞冷冻保护剂 DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上 清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀。往试管中加培养基、FBS（胎牛血清）各 80 滴和 20 滴（使 FBS 浓度为 20％）。用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶里成团，影响细胞生长。 5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出，加到培养瓶中，标记日期、细胞名称，再把培 养瓶放入 CO2 培养箱。（注意注意：加入到培养瓶后，培养瓶轻轻平放，用手拿培养瓶侧壁，左右上下轻轻摇 晃几次，使细胞均匀贴壁在培养瓶底。） 6、收拾所用物品、用 75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。 注意：注意： （1）入细胞室前观察 CO2%压力，左右，减压器表压力不低于！ （2）刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，让 FBS 浓度达到 20％。 （3）离心时间为 1～2min，速度为 800 转，不要离心太久，避免对细胞伤害较大。 （4）滴管使用注意事项：滴管使用注意事项： a.吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管一定要严格分开，不能混用，防止细胞间污染。吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管一定要严格分开，不能混用，防止细胞间污染。 b.培养基和 FBS（胎牛血清）可以用一个滴管，但分开用更好！ c.FBS（胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管,因为血清对胰酶活性有抑制作用。 d．胰酶和 PBS（平衡盐溶液）可以用一根滴管，不过最好分开 （5）不是所有的细胞复苏后都能活。死亡原因：冻存时间太长（如 2 年以上），技术不过关（如吹 打太激烈）、细胞传代数太多等。 （6）关于 PBS（平衡盐溶液）: a. PBS 溶液配好后要高压灭菌后才能用；PBS 高压时其瓶塞一定要插针头。 b. PBS 和培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质， 但需用温过的 PBS 冲洗细胞中的杂质。 PBS 虽然冲洗杂质效果较好，但它有使细胞易脱壁的倾向，故不可经常冲洗细胞。 c．不温的 PBS 用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备，使细胞加入胰酶后易消化。 d．消化后暂时不养细胞的培养瓶，可以往其中加入 2～3ml PBS（防止培养瓶干燥），培养瓶 放 CO2 培养箱里短时间保存。下次用该培养瓶再养同种细胞时，把 PBS 吸出弃去，再用培养基冲洗一遍即 可再用。 （7）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，而在 4℃时，其毒性大大减弱，故冻存的细胞 复苏后应及时洗涤冷冻保护剂 DMSO（离心后弃去上清），防止 DMSO 在常温下对细胞产生较大毒性！ 细胞换液细胞换液 1、倒置显微镜下观察细胞生长状态： a.移动细胞培养瓶时，观察到呈漂浮状态的细胞为死细胞； b.生长状态良好的细胞：透明度大、折光性强、轮廓不清；能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生 长期时可以见到很多分裂期细胞。 c.生长状态不良的细胞:细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞 间空隙加大，细胞变得不规则，失去原有特点