诺氟沙星胶囊微生物限度检查方法学验证探析
诺氟沙星胶囊微生物限度检查方法学验证 探析 【摘要】通过试验,确认所采用方法适用于诺氟沙星胶 囊微生物限度检查。方法:按品种项下微生物限度检查规定 对每一试验菌逐一进行验证。结果:诺氟沙星胶囊的微生物 限度检查过程需要消除其抑菌性。结论:采用低速离心和薄 膜过滤(加入硫酸镒溶液中和)的方法用于诺氟沙星胶囊的 微生物限度检查。 【关键词】诺氟沙星胶囊微生物限度检查 Abstract : The paper is mainly about the study of the validation of obvious capsule microbial limit inspection ology. 1.验证材料: 1. 1供试品:诺氟沙星胶囊(0. 25g)(批号为:A201009220 A201009221 A201009222)o 1.2培养基及试液:营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、营养肉 汤、乳糖胆盐培养基、改良马丁、四硫磺酸钠、胆盐硫乳琼 脂、曙红亚甲蓝琼脂、PH7.0氯化钠-蛋白月东缓冲液、硫酸 镒溶液(0. Imol /L,分析纯)。 1.3菌种:枯草芽泡杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希 菌、白色念珠菌、黑曲霉 1.4仪器:电热恒温水浴锅、电动离心沉淀机。 2.验证步骤: 1菌液的制备: 2. 1. 1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽泡杆 菌、的新鲜培养物至营养肉汤培养基中,于30〜35C培养 18〜24小时,分别取各菌种培养液1ml加入9ml0. 9%无菌氯 化钠溶液中,10倍依次稀释,金黄色葡萄球菌稀释至10-5, 大肠埃希菌稀释至10-7,枯草芽泡杆菌稀释至10-5,约为 50〜100cfu/ml,备用。 2. 1.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基 中,于23〜28°C培养24〜48小时,取培养液1ml加入9ml0. 9% 无菌氯化钠溶液中,10倍依次稀释至10-6,约为50〜100 cfu/ml,备用。 2. 1.3取黑曲霉的新鲜培养物用5ml0. 9%无菌氯化钠溶 液适量与标准比浊管进行比较,取比浊后的菌悬液1ml加入 9ml0. 9%无菌氯化钠溶液中,10倍依次稀释至10-4,约为 50〜100 cfu/ml,备用。 2. 2供试液制备:取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠- 蛋白豚缓冲液至100ml,水浴(45C)保温振摇,分散混匀, 作为1: 10的供试液。 2. 3细菌、霉菌及酵母菌数计数验证试验 2. 3. 1试验组.: (1) 取规定量的供试液,置无菌条件离心(500转/分) 3分钟,取上清液置无菌试管中,用PH7.0无菌氯化钠-蛋白 月东缓冲液补至原量,混匀后取1ml加至100ml PH7. 0无菌氯 化钠-蛋白豚缓冲液中,并向其中加入0. Imol/L的硫酸镒溶 液10ml,混匀,然后按照中国药典2010版附录微生物限度 检查法中的薄膜过滤法进行过滤,单膜冲洗量1000 ml,并 在最后100ml冲洗液中加入相应试验菌液1ml,冲洗后取出 滤膜,菌面朝上,贴于营养琼脂培养基平板上,置规定条件 下培养,每株试验菌平行制备二个平皿。 (2) 霉菌、酵母菌计数:采用培养基稀释法。取1: 10 的供试液0. 2nd加至平皿中,并加入试验菌液1ml,立即倾 注玫瑰红钠琼脂培养基(温度低于45°C),置规定条件下培 养,每株试验菌平行制备二个平皿。 2.3.2菌液组:取稀释好的各菌液1ml,分别加入平皿 中,加入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基,置规定条 件培养,测定所加的试验菌数。每株试验菌制备二个平皿。 2.3.3供试品对照组:取规定量的供试品,方法同试验 组,加入相应的培养基,每株试验菌平行制备2个平皿。 2.3.4稀释剂对照组:取稀释剂1ml替代供试液,方法 同试验组,每株试验菌平行制备2个平皿。 2.3.5试验组回收率(%)= X100% 稀释剂对照组菌回收率(%)= ■ X100% 2.3.6培养:细菌计数平板30-35°C培养3天;霉菌、 酵母菌计数平板23-28°C培养5天,逐日点计菌数。 2.3.7判断标准:稀释剂对照组及试验组的菌回收率应 均不低于70%o 三次试验结果见表1、表2、表3。 4.控制菌检查方法的验证: 4. 1试验组:取1: 10的供试液10ml,置无菌条件离心 (500转/分)3分钟,取上清液置无菌试管中,用PH7.0无 菌氯化钠-蛋白豚缓冲液补至原量,混匀后转入100ml PH7. 0 无菌氯化钠-蛋白月东缓冲液中,并向其中加入0. Imol/L的硫 酸镒溶液10 ml,混匀,然后按照中国药典附录“微生物限 度检查法”中薄膜过滤法进行过滤,冲洗量单膜800 ml,并 在最后100ml冲洗液中加入相应试验菌液1ml,冲洗后取出 滤膜,加至100ml胆盐乳糖培养基中,置30〜35°C培养18〜 24小时。取培养物0. 2ml接种至含5ml MUG培养基的试管内, 培养,于5小时、24小时在366nm紫外线下观察,同时用未 接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光,为 MUG阳性;不呈现荧光,为MUG阴性。沿培养管的管壁加数 滴靛基质试液,液面呈玫瑰红色,为靛基质阳性;呈试剂本 色,为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。 4.2阴性对照组:方法同试验组,加入1ml阴性菌(即 金黄色葡萄球菌液,浓度同细菌数验证)。 三次试验结果见表4。 5.结果判断 5. 1细菌、霉菌及酵母菌计数验证结论:在三次独立的 平行试验中,稀释剂对照组的菌回收率均大于70%,试验组 的菌回收率均大于70%,可照此方法测定诺氟沙星胶囊的细 菌、霉菌及酵母菌数。 5.2控制菌验证结论:在三次独立的平行试验中,阴性 对照组未检出阴性对照菌,试验组检出阳性试验菌,可照此 方法进行诺氟沙星胶囊的控制菌检查。 表1细菌、霉菌及酵母菌数验证试验结果(1) 表2细菌、霉菌及酵母菌数验证试验结果(2) 表3细菌、霉菌及酵母菌数验证试验结果(3) 表4控制菌验证试验结果(1、2、3) 讨论: 以上验证结果表明,诺氟沙星胶囊采用上述方法进行微 生物限度检查,霉菌数、酵母菌数测定采用培养基稀释法, 细菌数测定采用低速离心(500转/分)3分钟、薄膜过滤(每 膜冲洗1000 ml)及加入硫酸镒溶液中和(0. Imol/L的硫酸 镒溶液10ml)的方法时,各试验菌的回收率均大于70%,控 制菌检查采用低速离心低速离心(500转/分)3分钟、薄膜 过滤(单膜冲洗800 ml)及加入硫酸镒溶液中和(0. Imol/L 的硫酸镒溶液10ml)o根据中国药典2010年版的相关规定, 此方法适用于诺氟沙星胶囊的微生物限度检查。 参考文献: [1] 中国药典2010年版. [2] 药品微生物检验技术苏德模马绪荣. (作者单位:哈药集团制药总厂)