诺氟沙星胶囊微生物限度检查方法学验证探析

诺氟沙星胶囊微生物限度检查方法学验证 探析 【摘要】通过试验，确认所采用方法适用于诺氟沙星胶 囊微生物限度检查。方法按品种项下微生物限度检查规定 对每一试验菌逐一进行验证。结果诺氟沙星胶囊的微生物 限度检查过程需要消除其抑菌性。结论采用低速离心和薄 膜过滤（加入硫酸镒溶液中和）的方法用于诺氟沙星胶囊的 微生物限度检查。 【关键词】诺氟沙星胶囊微生物限度检查 Abstract The paper is mainly about the study of the validation of obvious capsule microbial limit inspection ology. 1.验证材料 1. 1供试品诺氟沙星胶囊（0. 25g）（批号为A201009220 A201009221 A201009222）o 1.2培养基及试液营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、营养肉 汤、乳糖胆盐培养基、改良马丁、四硫磺酸钠、胆盐硫乳琼 脂、曙红亚甲蓝琼脂、PH7.0氯化钠-蛋白月东缓冲液、硫酸 镒溶液（0. Imol /L,分析纯）。 1.3菌种枯草芽泡杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希 菌、白色念珠菌、黑曲霉 1.4仪器电热恒温水浴锅、电动离心沉淀机。 2.验证步骤 1菌液的制备 2. 1. 1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽泡杆 菌、的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于30〜35C培养 18〜24小时，分别取各菌种培养液1ml加入9ml0. 9无菌氯 化钠溶液中，10倍依次稀释，金黄色葡萄球菌稀释至10-5, 大肠埃希菌稀释至10-7,枯草芽泡杆菌稀释至10-5,约为 50〜100cfu/ml,备用。 2. 1.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基 中,于23〜28C培养24〜48小时，取培养液1ml加入9ml0. 9 无菌氯化钠溶液中，10倍依次稀释至10-6,约为50〜100 cfu/ml,备用。 2. 1.3取黑曲霉的新鲜培养物用5ml0. 9无菌氯化钠溶 液适量与标准比浊管进行比较，取比浊后的菌悬液1ml加入 9ml0. 9无菌氯化钠溶液中，10倍依次稀释至10-4,约为 50〜100 cfu/ml,备用。 2. 2供试液制备取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠- 蛋白豚缓冲液至100ml,水浴（45C）保温振摇，分散混匀， 作为1 10的供试液。 2. 3细菌、霉菌及酵母菌数计数验证试验 2. 3. 1试验组. 1 取规定量的供试液，置无菌条件离心500转/分 3分钟，取上清液置无菌试管中，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白 月东缓冲液补至原量，混匀后取1ml加至100ml PH7. 0无菌氯 化钠-蛋白豚缓冲液中，并向其中加入0. Imol/L的硫酸镒溶 液10ml,混匀，然后按照中国药典2010版附录微生物限度 检查法中的薄膜过滤法进行过滤，单膜冲洗量1000 ml,并 在最后100ml冲洗液中加入相应试验菌液1ml,冲洗后取出 滤膜，菌面朝上，贴于营养琼脂培养基平板上，置规定条件 下培养，每株试验菌平行制备二个平皿。 2 霉菌、酵母菌计数采用培养基稀释法。取1 10 的供试液0. 2nd加至平皿中，并加入试验菌液1ml,立即倾 注玫瑰红钠琼脂培养基温度低于45C,置规定条件下培 养，每株试验菌平行制备二个平皿。 2.3.2菌液组取稀释好的各菌液1ml,分别加入平皿 中，加入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，置规定条 件培养，测定所加的试验菌数。每株试验菌制备二个平皿。 2.3.3供试品对照组取规定量的供试品，方法同试验 组，加入相应的培养基，每株试验菌平行制备2个平皿。 2.3.4稀释剂对照组取稀释剂1ml替代供试液，方法 同试验组，每株试验菌平行制备2个平皿。 2.3.5试验组回收率 X100 稀释剂对照组菌回收率 ■ X100 2.3.6培养细菌计数平板30-35C培养3天；霉菌、 酵母菌计数平板23-28C培养5天，逐日点计菌数。 2.3.7判断标准稀释剂对照组及试验组的菌回收率应 均不低于70o 三次试验结果见表1、表2、表3。 4.控制菌检查方法的验证 4. 1试验组取1 10的供试液10ml,置无菌条件离心 500转/分3分钟，取上清液置无菌试管中，用PH7.0无 菌氯化钠-蛋白豚缓冲液补至原量，混匀后转入100ml PH7. 0 无菌氯化钠-蛋白月东缓冲液中，并向其中加入0. Imol/L的硫 酸镒溶液10 ml,混匀，然后按照中国药典附录“微生物限 度检查法”中薄膜过滤法进行过滤，冲洗量单膜800 ml,并 在最后100ml冲洗液中加入相应试验菌液1ml,冲洗后取出 滤膜，加至100ml胆盐乳糖培养基中，置30〜35C培养18〜 24小时。取培养物0. 2ml接种至含5ml MUG培养基的试管内， 培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未 接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为 MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。沿培养管的管壁加数 滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本 色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。 4.2阴性对照组方法同试验组，加入1ml阴性菌（即 金黄色葡萄球菌液，浓度同细菌数验证）。 三次试验结果见表4。 5.结果判断 5. 1细菌、霉菌及酵母菌计数验证结论在三次独立的 平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率均大于70,试验组 的菌回收率均大于70,可照此方法测定诺氟沙星胶囊的细 菌、霉菌及酵母菌数。 5.2控制菌验证结论在三次独立的平行试验中，阴性 对照组未检出阴性对照菌，试验组检出阳性试验菌，可照此 方法进行诺氟沙星胶囊的控制菌检查。 表1细菌、霉菌及酵母菌数验证试验结果（1） 表2细菌、霉菌及酵母菌数验证试验结果（2） 表3细菌、霉菌及酵母菌数验证试验结果（3） 表4控制菌验证试验结果（1、2、3） 讨论 以上验证结果表明，诺氟沙星胶囊采用上述方法进行微 生物限度检查，霉菌数、酵母菌数测定采用培养基稀释法， 细菌数测定采用低速离心（500转/分）3分钟、薄膜过滤（每 膜冲洗1000 ml）及加入硫酸镒溶液中和（0. Imol/L的硫酸 镒溶液10ml）的方法时，各试验菌的回收率均大于70,控 制菌检查采用低速离心低速离心（500转/分）3分钟、薄膜 过滤（单膜冲洗800 ml）及加入硫酸镒溶液中和（0. Imol/L 的硫酸镒溶液10ml）o根据中国药典2010年版的相关规定， 此方法适用于诺氟沙星胶囊的微生物限度检查。 参考文献 [1] 中国药典2010年版. [2] 药品微生物检验技术苏德模马绪荣. （作者单位哈药集团制药总厂）