HPV16E7和Brn3a在宫颈癌前病变中的表达及其意义医学论文

HPV16 E7和Brn 3a在宫颈癌前病变中的表达及 其意义 【摘要】目的研究HPV16 E7和Brn 3a在各级宫颈癌前病变 (CIN)中的表达情况以及两者之间的关系，从分子生物学水平探讨 其作为宫颈癌前病变的特异性标志物的可能性，以期寻找新的宫颈癌 前病变筛查方法。方法对71例患者行宫颈薄层细胞学检查 (Thinprep Cell Test, TCT),并在阴道镜下组织学活检，其TCT 残留标本，用RT PCR法检测各标本中HPV16 E7和Brn 3a的 表达。结果HPV16 E7和Brn 3a表达按细胞学分级和病理学分 级其阳性率呈逐级增高趋势，差异均有显著性(P0.0001)o两 者作为宫颈癌前病变和HPV活化状态的诊断标志物，其结果是一致 的(PV0.05)。结论TCT残留标本适合进行RT PCR分析研究。 HPV16 E7可作为宫颈癌前病变和HPV活化状态的生物标志物。 Brn 3a可作为可靠的CIN3生物标志物和HPV致癌基因转录活化 的标志物。HPV16E7和Brn 3a相互作用，可能为宫颈高度癌变 发展的原因之一。 【关键词】 宫颈癌前病变；TCT;HPV16 E7;Brn 3a;RT PCR Significance of HPV 16 E7 and Brn 3a Expression in Cervical Neoplasia Key words: Cervical neoplasia; TCT; HPV16 E7; Brn 3a; RT PCR 宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，居女性肿瘤死亡原因的第三位。 据统计[1],每年有大约3.7万人发病,发病率以每年2%〜3%的速 度增长，与近年来宫颈癌的早期检出率增高及发病年轻化有关。在发 达国家，宫颈癌的发病率已明显下降，这在很大程度上归功于对癌前 病变的早期诊断和治疗。因为从宫颈癌前病变发展成宫颈癌，有一个 较长的过程，大约需5〜10年，在此期间加强宫颈防癌检查，尽早 发现异常症状，采取有效的治疗方案，可积极防止宫颈癌前病变发展 为癌。本实验利用新柏氏薄层液基细胞涂片检查(ThinPrep cell test,TCT)的残留标本，进行RT PCR检测，测定标本中16型人 乳头瘤病毒致癌蛋白E7 (HPV16 E7)和细胞转录因子Brn 3a 的mRNA表达情况，从分子学水平探讨宫颈癌前病变中高危型人乳 头瘤病毒(HR HPV)致癌基因活化情况，以及Brn 3a和HPV16 E7 作为宫颈上皮内癌变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN) 的生物标志物的特异性。 1资料和方法 1.1临床资料 选取2004年8月〜2004年11月在重庆医科大学附属第一医院 行宫颈TCT检查的71位患者，年龄21〜63岁，平均36.8岁，所 有患者在取样前均未接受任何妇科相关疾病的治疗，用宫颈刷刷取宫 颈细胞并洗入TCT保存液中备用。 1.2方法 1.2.1收集细胞标本 用RNase的离心管吸取lml TCT残留标本底层沉积物，离心后 弃上清，沉淀用PBS液洗2次，离心后去上清，-20°C保存备用。 1.2.2RT PCR 法（检测 HPV16E7 及 Brn 3a mRNA 的表达） TCT残留标本的总RNA提取参照Trizol试剂盒操作程序进行。 逆转录采用TaKaRa公司的AMVRT酶,方法按说明书进行。HPV16 E7基因引物设计参照文献［2］。上游引物：5 AGCTCAGAGGAGGAGGATGA 3 ,下游弓I 物： 5， GGTTTCTGAGAACAGATGGG 3，，预计扩增片段长度为 203bp ; Brn 3a基因引物设计参照文献［3］,上游引物: 5， GTCGACATGGACTCGGACACG 3，，下游引物： 5 AGCCCCCTCAGTAAGTGGCA 3，;内对照 F actin 基 因引物设计参照文献[4],上游引物： 5， ACACCTTCTACAATGAGCTG 3，， 下游 引物： 5 CTGCTTGCTGATCCACATCT 3，，扩增片段长度为 828bpo PCR 反应条件为 94°C预变性 5min; 94°C 45s, 58°C 45s, 72°C 45s,共3。个循环；72°C再延伸，10mino取PCR产物5口1, 1.5%琼脂糖凝胶电泳(80V, 40mA, 60min)o紫光灯下观察摄像。 1.3统计学分析 分析细胞学分级和病理学分级，各组HPV16 E7和Brn 3a的 mRNA的阳性表达情况，比较两者在宫颈表达中的关系，并进行x2 检验。 2结果 2.1细胞学和病理学诊断结果见表lo表171例患者的细胞学及 病理学诊断 2.2RT PCR检测结果 2.2.1HPV16 E7 mRNA 的表达情况 TCT残留标本中，HPV16 E7 mRNA的表达阳性率在细胞学诊 断和病理学诊断中，随病变严重程度，呈逐级上升趋势，见图1。在 细胞学诊断中，未见癌变细胞者(within normal limit,WNL)的 HPV16 E7阳性表达率为7.69% (1/13),不典型鳞状上皮细胞 (atypical squamous cells,ASC)为 29.41% (5/17),低度鳞状 上皮内病变 (low grade squamous intraepithelial lesion,LSIL) 为 31.58% (6/19),高度鳞状上皮内病变(high grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)为 59.09% (13/22),统计分析差 异有显著性意义(P0.01)o在病理学诊断中，炎症组的阳性表达 率为 0% (0/21), CIN1 组为 31.58% (6/19), CIN2 组为 6。％ (6/10), CIN3组为61.90 (13/21),统计分析差异有显著性意 义(P0.0001)o 2.2.2Brn 3a mRNA 的表达 Brn 3a mRNA的表达阳性率在细胞学和病理学诊断中，均随病 变严重程度呈上升趋势，见图2。在细胞学诊断中，WNL组的阳性 率为 7.69%(1/13),ASC组为 23.53%(4/17),LSIL组为 21.05% (4/19), HSIL组为72.73% (16/22),统计分析差异有显著性意 义(P0.001)o在病理学诊断中，炎症组阳性率为0% (0/21), CIN1 组为 5.26% (1/19), CIN2 组为 5。％ (5/10), CIN3 组为 90.48% (19/21),统计分析差异有显著性意义(P0.0001)o 3讨论 宫颈癌是一种感染性疾病，已得到共识，其病因主要是人乳头瘤 病毒感染。其中HR HPV感染是宫颈癌及癌前病变发生的主要始动 因素，国外已开始利用HR HPV DNA进行宫颈癌筛查。HR HPV 为维持自身的生存和复制，能合成一系列蛋白质，包括自身结构蛋白 (衣壳蛋白)和致癌蛋白(E2、E6、E7等转录因子)。这些致