直链淀粉,支链淀粉测定试剂盒

直链淀粉/支链淀粉测定试剂盒 用于测定淀粉中的直链淀粉和支链淀粉含量 AMYL 11/99 简介简介: : 决定谷物淀粉最终的特殊用途取决于淀粉众多特性中的直链淀粉/ 支链淀粉比率，因此，对于淀粉加工企业，淀粉中直链淀粉含量是 一项非常重要的指标。 测定谷物淀粉中的直链淀粉通常采用电位测定法、 糊化染色法或旋 光分析法，即通过测定碘与直链淀粉结合生成直链淀粉-碘复合物 的方法来评估直链淀粉含量，然而由于支链淀粉-碘复合物在此过 程中同样会形成，因此这些方法的准确性常遭到质疑。利用非比色 方法测定游离碘离子的减少和通过比色测定直链淀粉-碘复合物的 方法会导致高估直链淀粉的含量，是用此方法可能出现的更多问题 请参考Gibson et al11。 目前， 国际上普遍采用结果更加准确的利用伴刀豆凝集素A(Con A)(Con A) 沉降支链淀粉，然后测定直链淀粉含量的方法，在特定的温度、pH 和离子强度下，Con A可以特定的连接含吡喃葡萄糖基 [a-D-glucosepyranosyl]或吡喃甘露基[a-D-mannopyranosyl]的支链多 聚糖，因此会优先于直链淀粉与支链淀粉形成沉淀复合物。 原理原理: : 加入二甲基亚砜(DMSO)的淀粉样品通过加热被完全溶解，乙醇洗 脱样品中的油脂， 回收洗涤后的淀粉样品， 并用醋酸/钠盐溶液溶解， 加入Con ACon A后支链淀粉被特异性的沉降，离心分离支链淀粉，保存 于悬浮液中的直链淀粉被酶水解生成葡萄糖，利用葡萄糖氧化酶/ 过氧化物酶测定葡萄糖的含量。 溶解于醋酸/钠盐溶液中的总淀粉同 样可以被水解成葡萄糖，并利用萄糖氧化酶/过氧化物酶测定葡萄 糖。在510nm测定利用Con ACon A沉降后悬浮液中GOPOD吸光度的比率 变化来计算直链淀粉的浓度，同样道理可计算出总淀粉浓度。 此方法适用于所有的纯净淀粉样品纯净淀粉样品和谷物面粉。谷物面粉。 精确性精确性: : 对于纯净淀粉和~10%的谷物面粉，批内偏差 12,000 U/升 过氧化物酶 650 U/升 4-氨基安替比林0.4 mM 稳定性：4°C保存，2-3个月或-20°C保存，12个月 葡萄糖标准溶液葡萄糖标准溶液 葡萄糖标准溶液（100μg/0.1ml；保存于0.2%的苯甲酸中），室温保 存 5年。 淀粉参考标样淀粉参考标样 瓶签上标注有直链淀粉含量 缓冲液（试剂盒中未提供）缓冲液（试剂盒中未提供） 1. 1. 醋酸钠缓冲液醋酸钠缓冲液(100mM, pH 4.5)(100mM, pH 4.5) 5.9ml冰醋酸(,1.05g/ml)加入900ml蒸馏水，用1M NaOH(4g/100ml) 调节pH到4.5（大约需要30ml），然后加入叠氮化钠(0.2g)并补液至 1L。室温中保存。 注意：注意： 叠氮化钠是一种有毒化学物质应妥善保存。 叠氮化钠是葡萄糖缓冲 液稳定剂，稀释操作过程中必须带防护手套进行操作。 二甲基亚砜对皮肤具有刺激性，应谨慎使用。 2. 2. 浓缩浓缩Con ACon A缓冲液缓冲液(pH 6.4, 600mM)(pH 6.4, 600mM) 无水醋酸钠(BDH Cat No: 10236) -------------------49.2g 氯化钠(BDH Cat. No: 10241)----------------------- 175.5g CaCl2.2H2O (Mallinckrodt Cat. No: 4160)------------0.5g MgCl2.6H2O (BDH Cat. No: 10149) ------------------0.7g MnCl2.4H2O (Ajax Cat. No: 307) ---------------------0.7g 将上述试剂溶解于900ml蒸馏水中，滴加冰醋酸调节pH到6.4，用蒸 馏水补液至1L，4°C保存。 注意：注意：调节pH时必须谨慎小心，如果该溶液的pH低于6.4，将会产 生沉淀物，重新调节pH沉淀物不会再溶解，因此，必须重新 配置新的溶液。 3. Con A3. Con A缓冲液缓冲液( (工作液工作液): ): 使用当天，用100ml蒸馏水稀释30ml浓缩Con A缓冲液。 4. 4. 二甲基亚砜二甲基亚砜(DMSO)(DMSO) 分析纯试剂(BDH Analar Cat. No: 10323) 设备设备: : 1. 玻璃器具 -试管(圆底; 16x120 mm, 15ml) -容量瓶(25ml) -螺口戴帽样品管(10ml) 2. 离心机（2,000g） 3. 微量移液器(50-1000μl). 4. 连续分配器 5. 分析天平. 6. 分光光度计510 nm. 7. 漩涡混合器 8. 定时钟 9. 沸水浴锅 10.微量离心机（14,000g） 11.控温水浴箱（40°C） 12.微量离心管(2.0ml) 注意事项注意事项 1、淀粉样品必须用乙醇进行处理以去除油脂，如果样品不能用乙 醇处理，样品中的直链淀粉含量可能会被低估50% 实验步骤实验步骤 A.A. 淀粉前处理淀粉前处理 1、准确称取淀粉和面粉样品20-25mg，加入到螺口试管中，记 录样品重量（精确到0.1mg）。 注意：注意：每批试验必须包括参考标样 每第五个样品设定重复管 2、加入1ml的DMSO， 用漩涡混合器低速的轻轻振荡， 盖住试管 帽在沸水中加热直到完全溶解（大约1分钟），确保没有凝胶块 残留。 3、用漩涡混合器高速混合，再次将试管置于沸水浴锅中加热15 分钟，并间断性的用漩涡混合器高速混合。 4、室温下放置大约5分钟，加入2ml乙醇（95%），漩涡混合器 混合，并再次加入乙醇4ml，振荡，将形成淀粉沉淀物，静置试 管15分钟（或过夜）。 5、离心5分钟（2,000g），弃去悬浮液，并用吸水纸吸干试管中 的液体，确保去除所有的乙醇溶液。 6、加入2ml的DMSO， 用漩涡混合器低速振荡， 沸水浴锅中加热 15分钟，并间断性的混合，以避免凝胶形成。 7、加入4ml稀释的的Con A缓冲液（工作液），混合均匀，然后 转移到25ml的容量瓶中，并用Con A缓冲液反复冲洗试管并一同 加入容量瓶中，用Con A缓冲液定溶至刻度线。（此溶液为溶液此溶液为溶液 1 1） 注意：注意：必须在60分钟之内对此溶液进行测定。 B.B. 用用Con ACon A沉淀支链淀粉，并测定直链淀粉沉淀支链淀粉，并测定直链淀粉 1、取1ml 溶液溶液1 1到2.0ml的微量离心管中， 加入0.50ml的Con A缓 冲液(4mg/ml)， 盖紧试管， 轻轻的反复颠倒混合， 避免样品起泡避免样品起泡。 2、 3、 在室温中静置1小时，20°C下离心10分钟（14,000g）。 转移1ml的上层液到15ml的离心管中，加入3ml的醋酸钠缓冲 液 （100mMM; pH 4.5） ， 轻轻的盖住试管盖， 在沸水中加热5分钟。 4、将试管置于40°C的水浴箱中孵育5分钟，加入0.1ml的淀粉葡 萄糖苷酶/α-淀粉酶，并继续在40°C的水浴箱中孵育30分钟， 2,000g下离心5分钟。 5、加入4ml 的GOPOD试剂，在40°C下孵育20分钟，同时孵