基因工程使用CRISPR

基因工程使用基因工程使用 CRISPR-Cas9 systemCRISPR-Cas9 system 目标核酸酶是强大的工具对于高精度调节基因组。 来自微生物适应性免疫系统(crispr)的指导 RNA cas9 核酸酶可以被用来促进高效的真核细胞基因组工程，通过在其指导rna 内指定一 个 20-nt 目标序列。在这里,我们 描述一组用来基因组编辑工具 cas9-mediated，通过(NHEJ)或(HDR)在哺乳动物细胞中,以及 下游功能研究代转基因细胞系。 为了减少非目标分裂,我们进一步描述 double-nicking 策略使 用用配对的指导 rna 的 cas9 nickase 突变。这个协议提供了实验结果为指导的目标选择,分裂 效率的评价和分析非目标活动。目标设计、基因修改可以在短短 1-2 周实现,修改克隆细胞 株 2-3 周内可生成。 introductionintroduction 控制生物系统能力,在基础科学生物、药学和生物技术拥有巨大的应用潜力。可编程具体序 列核酸酶、 促进内源性基因位点的精确编辑现在可以实现系统基因组功能的讯问和在广泛的 物种基因变异,包括那些以前没有基因易处理的。最近几年出现了大量的基因组编辑技术,包 括(ZFNs),(Talens)和 crispr。前两种技术使用了限制核酸内切酶催化域来模块化DNA 结合蛋 白质的策略包括诱导 DNA 双链断裂(DSB)。 相比之下,Cas9 是小 rna 引导下的核酸酶,通过与 沃森克里克目标 DNA 碱基配对,代表系统明显更容易设计,非常具体、高效、很好的高产适 应度和对于多种类型的细胞和生物体有多路复用基因编辑。 使用工程核酸酶的基因组精确编辑使用工程核酸酶的基因组精确编辑 和 ZFNs 和 talens 很像,Cas9 通过刺激在目标基因位点DSB 促进基因组编辑。 通常根据 Cas9 分裂,目标位点进行DNA损伤修复的两个主要途径之一(图2):容易出错NHEJ或高保真HDR 途径,两者都可以用来实现所需的编辑结果。缺乏修复模板情况下， DSB 通过 NHEJ 重新捆 绑,使缺口发生插入/删除(indel)的突变。 NHEJ 可以被用来调节基因淘汰,indels 发生在编码外 显子会导致移码突变和过早地停止密码子。多个DSB 另外可以用来调解更大的基因组中删 除。 HDR 是另一个主要的 DNA 修复途径。尽管 HDR 通常发生在比 NHEJ 更低, 频率更多样的 情况下， 它可用于在外在的引入修复模板存在的情况下在目标位点生成精确明确修改。 修复 模板的形式可以是使用同源臂侧面插入序列的传统双链DNA 目标结构,或单链 DNA 寡核苷 酸(ssODNs)。后者提供了一种有效而简单的方法使小编辑基因组中,如探索随机的基因变异 的单核苷酸突变。 与 NHEJ 不一样,HDR 通常只在细胞分裂活跃,和它的效率差别很大取决于 细胞类型和状态,以及基因位点和修复模板。 Cas9:Cas9: 对于基因组编辑的对于基因组编辑的 RNARNA 引导核苷酸引导核苷酸 Crispr-cas 是用 RNA 引导核苷酸来分开外来基因元素的微生物适应性免疫系统。三种类型 (1-3)CRISPR 系统已经被确认在广泛的宿主细菌和古细菌存在,其中每个系统由一群 CRISPR-associated(Cas)基因,非编码 rna 和一系列独特的重复元素(直接重复)。 这些重复被隔 开通过短的多样的来自外源DNA 序列目标 （称为 protospacers）,和他们一起构成了 CRISPR RNA(crRNA)排列。在DNA 目标内,每个 protospacer 总是与 protospacer adjacent motif (PAM) 相连，可多样化依赖于特定的 CRISPR 系统。 II 型 CRISPR 系统是一个最好的特点的、 ,由核酸酶 Cas9,crRNA 排列编码指导 rna 和必需的、 辅助的、促进crRNA 排列变成离散单元的进程的trans-activating crRNA(tracrRNA)。然后每 个 crRNA 单元包含一个 20-nt 指导序列和部分直接重复,前者指导 Cas9 变成 20-bp DNA 目 标通过沃森克里克配对 (图 1)。在来自酿脓链球菌和CRISPR-Cas system中， (该协议中使 用的系统),目标 DNA 必须立即先于 5-NGG PAM， 图1 |示意图的RNA-guided Cas9 核酸酶。从化脓性链球菌(黄色)来的 Cas9 核酸酶是针对基因组 DNA(例如人类EMX1位点)通过一个20-nt引导序列(蓝色)和支架(红色) 组成的 sgRNA。引导序列(蓝色栏上链) 在直接上游的必需的 5-NGG(PAM,粉色)与 DNA 目标配对。 Cas9 在上游的PAM(红色三角形)。 协调 DSB~ 3bp。 而其他 Cas9 直接同源可能有不同的PAM 需求,如 S. thermophilus (5-NNAGAA for CRISPR1 和 5-NGGNG for CRISPR3)和脑膜炎双球菌(5-NNNNGATT)。 CRISPR-Cas 的 RNA 引导的核酸酶的作用是通过不同表达人类最优密码子的 Cas9 和必要的 RNA 来组成重组在哺乳动物细胞上。此外,crRNA 和 tracrRNA 融合在一起来创建一个嵌合, 单引导的 RNA(sgRNA)(图 1)。Cas9 因此可以通过改变 sgRNA 在内的 20-nt 引导序列在最接 近的 PAM 序列上重新定向到几乎所有的兴趣目标。 由于其易于实现和多路复用能力,Cas9 一直用于通过 NHEJ 和 HDR 生成带着特定突变工程真 核细胞型。直接注入 sgRNA 和信使 rna 编码 Cas9 成胚胎在多个等位基因修改上使转基因小 鼠快速传代。这些结果编辑生物的巨大前景,否则基因棘手。 Cas9 核酸酶利用保守的ＨＮＨ和 RuvC 核酸酶域进行特定断裂分裂,这可以突变和利用额外 的功能。 aspartate-to-alanine(D10A)突变在 RuvC 催化域下允许 Cas9 切口酶突变(Cas9n) 而不是分裂 DNA 单链断裂,后续优先修理通过HDR 可以潜在地从 off-target的ＤＳＢs 减少 不必要的 indel 突变的频率。 适当的补偿 sgRNA 可以指导 Cas9n 同时刻痕于目标位点来调节 DSB,从而有效地增加目标识别的特异性。此外,Cas9 突变与 DNA-cleaving 催化残基突变已 经适应了在大肠杆菌启用转录调控,证明构建 Cas9 的潜力对于不同的应用程序,如荧光蛋白 标签的补偿或染色质——修改特定基因位点酶报告或调节基因功能。 这里我们详细解释如何使用人类的密码子优化、细胞核定位侧面的序列野生型(WT)Cas9 核 酸酶或突变 Cas9 切口酶促进真核基因编辑。 我们描述设计 20-nt 引导序列的原因,和快速建 设和功能验证 sgRNAs 协议，最后使用 Cas9 核酸酶来调解 NHEJ-based 和 HDR-based 基因组 修改(HEK 293 英尺)和人类干细胞(H