细胞冻存、复苏、传代、转染超详细版

细胞培养系列方法细胞培养系列方法 【实验前准备】【实验前准备】 （1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul 枪头、PBS 溶液。 （2）清洁超净工作台面，照紫外 30 分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、 胰酶 PBS 液、双抗置于室温下复温。 细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏 【实验用品】【实验用品】 （1） 材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合） 、于液氮中冻存的细胞 （2） 试剂： PBS 液、 0.25%胰蛋白酶液、 DMEM 培养基、 胎牛血清、 二甲亚砜 （DMSO） 、 双抗 （3） 设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml 离心管、1.5ml 冻存管、盛酒精的喷壶、 酒精灯、水浴锅、CO 2 培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作 台。 试剂配制： （1）完全培养基含 90%DMEM 培养液加 10%的胎牛血清加 1%的双抗。 （2）冻存液含 80%的 DMEM 培养基加 10%的胎牛血清加 10%的 DMSO，用吸 管混匀，置于 4℃冰箱中备用。 细胞的冻存细胞的冻存 (1)依照传代的方法用 0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。 (2)收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min 离心 5min。 (3)弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为 5*106-1*107个/ml。 (4)每个冻存管分装细胞悬液 1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。 (5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。 (6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过 夜→转入液氮灌中。 细胞的复苏细胞的复苏 （1） 准备水浴锅，调温度至 37℃。打开离心机。 （2） 用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管 1只， 迅速将其置入 38℃水浴锅中， 不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。 （3） 用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。 （4） 将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加 10 倍体积的 DMEM 培养基， 吹打混匀。 （5） 1000r/min 离心 5min，弃上清液。 （6） 加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。 （7） 按 5*105个/ml 的细胞浓度， 将细胞接种在培养瓶中， 置于培养箱中培养。 （8） 24h 后取出培养瓶，观察细胞生长状况。 【注意事项】【注意事项】 （1） 对数期的细胞增值能力强， 冻存后生存率较高， 因此， 在进行细胞冻存时， 应尽量选择处于此期的细胞加以冻存。 （2） 为了保证复苏后细胞的存活率，复苏接种时，细胞的浓度不能太低，最好 控制在 5*106-1*107个/ml，这样才能保证复苏成功。 （3） 冻存管的瓶盖应封盖严密，以免复苏时细胞外溢。 （4） 复苏时， 从液氮取出冻存管到水浴中融化的过程要快，否则会导致冰晶的 形成，伤害细胞。同时，一次复苏的冻存管数量不要太多，否则会引起水 浴锅中传热不佳，延缓冻存的细胞悬液融化的时间。 （5） 为防止液氮冻伤，注意戴上防护手套。 【实验结果及分析】【实验结果及分析】 经复苏刚接种的细胞是悬浮于培养基中的。 复苏成功的细胞 24h 左右可贴壁， 48h 后即可开始生长、增殖。复苏不成功的细胞，将继续悬浮于培养液中，不能 贴壁。 细胞的传代培养细胞的传代培养 【实验用品】【实验用品】 （1） 材料：原代培养的肝细胞、原代培养的外周血淋巴细胞 （2） 试剂：PBS 液、DMEM 培养基（含10%小牛血清） 、0.25%胰蛋白酶消化液 （3） 设备：25ml 培养瓶、吸管、离心管、酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置 显微镜、超净工作台、C02 培养箱 【实验方案】【实验方案】 1. 贴壁细胞的传代培养 （1） 用吸管吸出原代培养的肝细胞培养瓶中培养液。 （2） 向瓶内加入适量的 PBS 液，轻轻摇动后倒掉。 （3） 每 25ml 的培养瓶内加入 0.25%胰蛋白酶消化液 1ml，消化液的量以覆 盖整个细胞培养面为宜， 置于 37℃的培养箱环境中。 轻轻摇动培养瓶， 在倒置显微镜下对培养细胞进行观察，当细胞胞质回缩、细胞间隙增 大时，迅速将消化液吸出。 （4） 加入 PBS 液于培养瓶中，轻轻转动培养瓶，然后用吸管将溶液吸出， 加入含血清的培养液终止消化。 （5） 用吸管吸取培养液，反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的部位 应均匀，可按从上到下、从左到右的顺序进行，保证瓶底各个部位的 细胞均能被吹到。此外，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以 免损伤细胞。 （6） 将吹打后的细胞置于倒置显微镜下观察，当发现原贴壁的细胞均已悬 浮于培养液中，成片的细胞已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止 吹打。 （7） 收集细胞悬液于离心管中，1000r/min，离心 5-8min，去除上清。 （8） 细胞计数，按照 1*105-1*106个细胞的密度接种细胞于新培养瓶中。 2. 悬浮细胞的传代 （1） 将原代培养的外周血淋巴细胞连同培养液一并转移到离心管中。 （2） 800-1000r/min 离心 5min，去除上清液。 （3） 加新的培养液到离心管中，吸管吹打、制悬。根据细胞的数量多少， 将细胞悬液按 1:2 或 1:3 的比例分别接种于新的培养瓶中。 【注意事项】【注意事项】 （1） 消化过程中需根据培养细胞形态的变化来严格控制消化时间。 当胞质回缩、 细胞间的连接变松散等情况出现时， 应终止消化。因上皮样细胞彼此间连 接较为紧密，其消化时的时间通常比成纤维细胞长。此外，首次传代的细 胞与已建系的细胞相比，也需要更多的消化时间。 （2） 首次传代的细胞因需适应新的环境， 可适当增加其接种量，以促进生存与 增殖。 （3） 在对细胞进行吹打时，不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。 （4） 传代培养的过程通常较长，细胞被污染的可能增加，因此，必须严格进行 无菌操作。 【实验结果及分析】【实验结果及分析】 用倒置显微镜观察可见接种 24h 后， 大多数肝细胞已贴附于培养瓶底部， 有 少数细胞悬浮于培养基中。48h 以后，细胞开始增殖、细胞的数量增多，在接种 的肝细胞或肝细胞团周围可见新生细胞长出，这些细胞内含物少而较为透明，胞 体轮廓通常较浅。96h 以后，培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合，细胞轮廓清 晰、可见。 细胞转染细胞转染 【实验用品】【实验用品】 细胞、6 孔板、血清、培养基 DMEM、OPTI-MEM、GSK-3/wt 的质粒、 Lipofectamine2000、 GSK-3/wt 的质粒、 链霉素/青霉素 （双抗） 、 FCS （小牛血清） 、 PBS（磷酸盐缓冲溶液） 、胰酶 1. 细胞的准备 实验前一天，将细胞接种入6孔板中，每孔中培养基的体积为1ml，细胞环境 控制在37℃、5% CO2培养箱中培养24小时。待细胞达到90%丰度时，准备转染， 在转染前一晚换新鲜的有血清培养基，使细胞状态良好。 2.转染GSK-3/wt的质粒 (1) 准备无血清培养基DMEM，OPTI-MEM，转染试剂Lipofectamine2000。 (2) 转染前一小时弃去培养板中的旧培养基，换预先预