细胞冻存、复苏、传代、转染超详细版

细胞培养系列方法细胞培养系列方法 【实验前准备】【实验前准备】 （1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul 枪头、PBS 溶液。 （2）清洁超净工作台面，照紫外 30 分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、 胰酶 PBS 液、双抗置于室温下复温。 细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏 【实验用品】【实验用品】 （1） 材料培养的贴壁细胞（70-80融合） 、于液氮中冻存的细胞 （2） 试剂 PBS 液、 0.25胰蛋白酶液、 DMEM 培养基、 胎牛血清、 二甲亚砜 （DMSO） 、 双抗 （3） 设备培养瓶、巴氏吸管、15ml 离心管、1.5ml 冻存管、盛酒精的喷壶、 酒精灯、水浴锅、CO 2 培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作 台。 试剂配制 （1）完全培养基含 90DMEM 培养液加 10的胎牛血清加 1的双抗。 （2）冻存液含 80的 DMEM 培养基加 10的胎牛血清加 10的 DMSO，用吸 管混匀，置于 4℃冰箱中备用。 细胞的冻存细胞的冻存 1依照传代的方法用 0.25胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。 2收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min 离心 5min。 3弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为 5*106-1*107个/ml。 4每个冻存管分装细胞悬液 1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。 5在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。 6将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过 夜→转入液氮灌中。 细胞的复苏细胞的复苏 （1） 准备水浴锅，调温度至 37℃。打开离心机。 （2） 用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管 1只， 迅速将其置入 38℃水浴锅中， 不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。 （3） 用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。 （4） 将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加 10 倍体积的 DMEM 培养基， 吹打混匀。 （5） 1000r/min 离心 5min，弃上清液。 （6） 加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。 （7） 按 5*105个/ml 的细胞浓度， 将细胞接种在培养瓶中， 置于培养箱中培养。 （8） 24h 后取出培养瓶，观察细胞生长状况。 【注意事项】【注意事项】 （1） 对数期的细胞增值能力强， 冻存后生存率较高， 因此， 在进行细胞冻存时， 应尽量选择处于此期的细胞加以冻存。 （2） 为了保证复苏后细胞的存活率，复苏接种时，细胞的浓度不能太低，最好 控制在 5*106-1*107个/ml，这样才能保证复苏成功。 （3） 冻存管的瓶盖应封盖严密，以免复苏时细胞外溢。 （4） 复苏时， 从液氮取出冻存管到水浴中融化的过程要快，否则会导致冰晶的 形成，伤害细胞。同时，一次复苏的冻存管数量不要太多，否则会引起水 浴锅中传热不佳，延缓冻存的细胞悬液融化的时间。 （5） 为防止液氮冻伤，注意戴上防护手套。 【实验结果及分析】【实验结果及分析】 经复苏刚接种的细胞是悬浮于培养基中的。 复苏成功的细胞 24h 左右可贴壁， 48h 后即可开始生长、增殖。复苏不成功的细胞，将继续悬浮于培养液中，不能 贴壁。 细胞的传代培养细胞的传代培养 【实验用品】【实验用品】 （1） 材料原代培养的肝细胞、原代培养的外周血淋巴细胞 （2） 试剂PBS 液、DMEM 培养基（含10小牛血清） 、0.25胰蛋白酶消化液 （3） 设备25ml 培养瓶、吸管、离心管、酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置 显微镜、超净工作台、C02 培养箱 【实验方案】【实验方案】 1. 贴壁细胞的传代培养 （1） 用吸管吸出原代培养的肝细胞培养瓶中培养液。 （2） 向瓶内加入适量的 PBS 液，轻轻摇动后倒掉。 （3） 每 25ml 的培养瓶内加入 0.25胰蛋白酶消化液 1ml，消化液的量以覆 盖整个细胞培养面为宜， 置于 37℃的培养箱环境中。 轻轻摇动培养瓶， 在倒置显微镜下对培养细胞进行观察，当细胞胞质回缩、细胞间隙增 大时，迅速将消化液吸出。 （4） 加入 PBS 液于培养瓶中，轻轻转动培养瓶，然后用吸管将溶液吸出， 加入含血清的培养液终止消化。 （5） 用吸管吸取培养液，反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的部位 应均匀，可按从上到下、从左到右的顺序进行，保证瓶底各个部位的 细胞均能被吹到。此外，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以 免损伤细胞。 （6） 将吹打后的细胞置于倒置显微镜下观察，当发现原贴壁的细胞均已悬 浮于培养液中，成片的细胞已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止 吹打。 （7） 收集细胞悬液于离心管中，1000r/min，离心 5-8min，去除上清。 （8） 细胞计数，按照 1*105-1*106个细胞的密度接种细胞于新培养瓶中。 2. 悬浮细胞的传代 （1） 将原代培养的外周血淋巴细胞连同培养液一并转移到离心管中。 （2） 800-1000r/min 离心 5min，去除上清液。 （3） 加新的培养液到离心管中，吸管吹打、制悬。根据细胞的数量多少， 将细胞悬液按 12 或 13 的比例分别接种于新的培养瓶中。 【注意事项】【注意事项】 （1） 消化过程中需根据培养细胞形态的变化来严格控制消化时间。 当胞质回缩、 细胞间的连接变松散等情况出现时， 应终止消化。因上皮样细胞彼此间连 接较为紧密，其消化时的时间通常比成纤维细胞长。此外，首次传代的细 胞与已建系的细胞相比，也需要更多的消化时间。 （2） 首次传代的细胞因需适应新的环境， 可适当增加其接种量，以促进生存与 增殖。 （3） 在对细胞进行吹打时，不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。 （4） 传代培养的过程通常较长，细胞被污染的可能增加，因此，必须严格进行 无菌操作。 【实验结果及分析】【实验结果及分析】 用倒置显微镜观察可见接种 24h 后， 大多数肝细胞已贴附于培养瓶底部， 有 少数细胞悬浮于培养基中。48h 以后，细胞开始增殖、细胞的数量增多，在接种 的肝细胞或肝细胞团周围可见新生细胞长出，这些细胞内含物少而较为透明，胞 体轮廓通常较浅。96h 以后，培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合，细胞轮廓清 晰、可见。 细胞转染细胞转染 【实验用品】【实验用品】 细胞、6 孔板、血清、培养基 DMEM、OPTI-MEM、GSK-3/wt 的质粒、 Lipofectamine2000、 GSK-3/wt 的质粒、 链霉素/青霉素 （双抗） 、 FCS （小牛血清） 、 PBS（磷酸盐缓冲溶液） 、胰酶 1. 细胞的准备 实验前一天，将细胞接种入6孔板中，每孔中培养基的体积为1ml，细胞环境 控制在37℃、5 CO2培养箱中培养24小时。待细胞达到90丰度时，准备转染， 在转染前一晚换新鲜的有血清培养基，使细胞状态良好。 2.转染GSK-3/wt的质粒 1 准备无血清培养基DMEM，OPTI-MEM，转染试剂Lipofectamine2000。 2 转染前一小时弃去培养板中的旧培养基，换预先预