筛选稳定表达细胞系经验总结

G418G418 筛选稳定表达细胞系经验总结筛选稳定表达细胞系经验总结 我做了稳定转染，从G418 浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有自己的体会也有其 他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。 筛选之前确定筛选之前确定 G418G418 浓度：浓度： 1、由于每种细胞对 G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的 G418 有效成分的比 重不同，一般 1g 的粉剂中有效的 G418 含量大约为。 2、G418 是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死 细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而 G418 对细菌和真核细胞都起作用。neo 就是 编码 3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素 G418。在进行转染时细胞 膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418 有杀菌作用，所以有人主张 转转染时不加其它抗生素。 3、汇合度对 G418 筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过 50% 4，G418 的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定 G418 的最佳筛选浓度。具 体如下：将细胞稀释到 1000 个细胞/ml，在 100ug/ml~1mg/ml 的 G418 浓度范围内 进行筛选，选择出在 10~14 天内使细胞全部死亡的最低 G418 浓度来进行下一步的筛 选试验。一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种 1/4000，1/1000，1/300 细 胞到24孔板中， 48h后加药筛选， 此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。 理论上1/4000 孔内应有 4%的汇合度。筛选 9 天后，观察 1/4000 孔内有两三个克隆，按比例 1/300 孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。 加药时间和维持浓度加药时间和维持浓度 1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但 是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被 没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染 24 小时 之后才开始加 G418 筛选。 随着细胞的代谢 G418 的浓度和活性都会下降，所以每 3~5 天都要更换一次含有 G418 的筛选液。这时药物浓度可以降至 200ug/ml。 2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一 般是转染 48 小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的 1/2。 关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。而且，如果你 要挑选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基 因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。 筛选时的培养液筛选时的培养液 加药筛选约 6 天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个 问题： 1， 死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有 neo 表达的阳性细胞死亡，即非 选择性死亡，因此要及时换液 2 ，孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚 至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染 3T3 细胞，在 3T3 细胞汇合 度达到 80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养 液按 1：1 混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。 3，适当增加血清浓度。 筛选时出现的问题及其解决办法：筛选时出现的问题及其解决办法： 1， 问题 1。做 hela 细胞的筛选，现在已经筛选 3 周，在 6 孔板中已经长出一些细胞 簇，想把它挑到 96 孔板中，就用 2ul 胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经 四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起（我的细胞簇离的很近） ，就是说几个细胞簇 被胰酶融合在一起，那样根本没有办法做下去了，该怎么办 a、可以减少胰酶量；胰酶在加入之前要用 37 度温箱预热，并且 PBS 润洗细胞层，以 减少可能残存的血清的影响； b、加入胰酶后，稍过几秒钟就可以吸走消化液了，不用吸干净，然后放到 37 度温箱 中继续作用 1MIN，这时，消化酶可以继续作用的，又可避免胰酶扩散； c、显微镜下观察细胞完全松散开，就可以在你感兴趣的局部加培养基，并吸走你的可 隆了呀 d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果在步骤 2 中显微镜下见细胞尚未完全松散 开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。 我的建议：1、在100mm dish 中挑克隆，细胞分的稀一点。2、把细胞全部消化下来， 在 96 孔板中逐步稀释获得单克隆 2，问题 2。筛选成功的概率：只要有抗性加压筛选，挑选到的机率还是比较大的。一 般能挑到稳定表达的概率我认为大概有 70－80％，但是想挑到表达量高且能稳定表达 的，不大容易。这个可能是在染色体上，合适的整合位点太少的缘故。 3，问题 3。细胞形态的改变：稳定转染后阳性克隆均出现不同程度的细胞形态的改变。 想请教各位有经验的高手，你们做稳定转染时有此发现吗我的也是，而且好象还有好几 种不同类型的细胞。不过，我转的是一种抑癌基因。 4，问题 4。单克隆化的时机和个数：加药筛选时, 一般等到确认的转染细胞长到 70% 以上时,再做有限稀释法, 以克隆出阳性细胞, 同时要保持适当的药物浓度 ,以防突变和 污染。若细胞长好了,如有 40%以上,就可以有限稀释了一般，筛选 5，6 个克隆就有需 要的克隆，但保险起见，筛 10 个吧。 5，从单克隆化时开始，就要加大营养，清和生长因子。单克隆化的操作方法； 1.方法 1。单克隆细胞的培养就是这样的,我现在作了 15 个 96 孔板的单克隆,总共才得 到大约 50 株单克隆在做时候应保证每个孔中的细胞是一个,因此,我一般在 200 毫升的 培养液中加入小于96个的细胞,这样平均到每个孔中因该可以由满意的结果你所说的现 象我也遇到过,我也百思不得其解,只好做多一点的 96 孔板来补充。培养SPC-A1（人肺 癌细胞） ，转染了 EGFP，然后进行了 G418 抗性筛选和 96 孔板单克隆筛选，最终获得 了成功将我的实验步骤写出来，希望对你有所帮助。 2.方法 2。实验步骤大致为：预先对 96 孔板除第一排之外的所有孔加含 15%胎牛血清 的细胞培养液，孔，并放于细胞培养箱中温育，然后胰酶消化稳定表达 GFP 的细胞， 细胞液稀释至密度为 1000cell/ml 的单细胞悬浮液，上述细胞液接种于 96 孔板的第一 排，孔，从中吸取细胞溶液接种于第二排，混合后，从第二排中吸取接种于第三排……， 一直到第八排，最后一排都丢弃细胞液，操作示意图见下图。一般来说，每一列都会有 某个孔中只有 1~2 个细胞。 3.方法 3。我的改进之处：我在显微镜下观察，标记孔中小于 10 个细胞的孔，然后在 显微镜下用记号笔在皿底把单个荧光细胞圈住， 然后在操净台里用灭过菌底牙签将圈外 的细胞戳死，这样留在孔中的就是单克隆了，通过这样的，我一共获得了 6 株单克隆。 但需注意的是：时间不能超过 30min，否则细胞极容易死亡。解决操作时间长的方法： 拿一个 96 板