蛋白质分子量测定 液相色谱-飞行时间质谱-征求

` ICS 71.040.40 CCS N 04 中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准 GB/T XXXXX—XXXX 蛋白质分子量测定 液相色谱-飞行时间质 谱联用法 Determination of protein molecular weight by liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry (点击此处添加与国际标准一致性程度的标识) （征求意见稿） 在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。 XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施 GB/T XXXXX—XXXX I 目次 前言 . II 1 范围 3 2 规范性引用文件 3 3 术语和定义 3 4 分析方法原理 4 5 试剂和材料 4 6 仪器 5 7 样品处理 5 8 分析步骤及方法 5 9 数据质量的保证 6 GB/T XXXXX—XXXX II 前言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由全国仪器分析测试标准化技术委员会（SAC/TC 481）提出并归口。 本文件主要起草单位： 本文件主要起草人： GB/T XXXXX—XXXX 3 蛋白质分子量测定 液相色谱-飞行时间质谱联用法 1 范围 本文件规定了使用液相色谱-飞行时间质谱联用法进行蛋白质分子量的测量以及对测量数据进行分 析的通用规则。 本文件适用于重组蛋白质、组织提取蛋白质以及合成蛋白质及高分子量多肽的分子量测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 《中国药典》三部 - 人用重组 DNA 蛋白制品总论 《中国药典》三部 - 人用重组单克隆抗体制品总论 《中国药典》0431 质谱法 European Pharmacopeia 2.2.43. MASS SPECTROMETRY USP 736 Mass spectrometry GB/T 6041-2020 质谱分析方法通则 GB/T 37849-2019 液相色谱飞行时间质谱联用仪性能测定方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 重组蛋白质 recombinant proteins 重组蛋白质是采用重组 DNA 技术，利用质粒或病毒载体，将编码所需蛋白质的基因导入适当的宿 主细胞，通过宿主细胞表达，并经过提取纯化等步骤获得的蛋白质。 平均分子量 average molecular mass 根据分子式，按组成元素的平均原子量计算所得的分子量。如碳元素按 12.0107 计算，氢元素按 1.0079 计算。 单同位素分子量 isotope molecular mass 根据分子式，按组成元素的最低同位素原子量计算所得的分子量。如碳元素按 12.0000 计算，氢元 素按 1.0078 计算。 质荷比 mass to charge ratio，m/z GB/T XXXXX—XXXX 4 质荷比指带电离子的质量与所带电荷之比值，以 m/z 表示。 电喷雾离子化 ESI, electrospray ionization 在高电压电场作用下，样品溶液由毛细管中喷出，形成带电雾滴；雾滴中溶剂蒸发，雾滴变小，库 仑力增大，发生分裂；该过程多次重复，带电雾滴的尺寸达到纳米级别，液相中离子转变为气相离子， 从而进入质谱仪被检测。 飞行时间质谱仪 time-of-flight mass spectrometer 飞行时间质谱仪采用飞行时间质量分析器进行离子质荷比分离。由离子源产生的离子在加速电场 作用后以恒定速度经过高真空无场离子漂移管到达离子接收器。离子的速度与离子的质荷比平方根成 反比，离子质量越大，到达接收器所用时间越长；反之，质量越小，到达接收器所用时间越短。因此可 以根据离子到达接收器所用时间把不同质量的离子按质荷比大小进行分离。 离子阱质谱仪 ion trap mass spectrometer 以离子阱作为质量分析器的质谱分析仪器。离子阱质量分析器是基于四极场理论对带电粒子进行 捕获，囚禁，储存，筛选以及分离的质量分析装置。 质量轴校准 calibration 使用校准溶液调整质谱仪的质量轴，将实测质荷比与校准溶液中已知的一系列质荷比进行匹配。 扫描范围 scan range 质谱仪采集数据时扫描的质荷比范围，测定时应根据待测蛋白质的分子量大小及离子化特性选择 合适的扫描范围。 总离子流图 total ion chromatogram，TIC 在色谱-质谱联用分析中，质谱检测器的总离子流强度随时间的变化曲线。又称总离子流色谱图。 原始质谱图 raw spectrum 采用电喷雾离子化检测时， 待测蛋白的质谱采集数据加合在一起得到质谱图， 由一系列连续的多价 态带正电荷的峰组成，相邻峰所带电荷数差值为 1。 解卷积 deconvolution 蛋白的原始质谱图通过软件算法，将一系列连续多价态带正电荷的质谱数据转换成不带电荷的蛋 白分子量数据的过程。 4 分析方法原理 待测蛋白根据其性质在液相色谱中进行分离， 然后进入质谱仪的离子源区域， 通过电喷雾离子化成 为带电离子， 带电离子经过一系列离子透镜聚焦后进入飞行时间或离子阱等质量分析器， 由检测器检测 并记录各带电离子的飞行时间及离子丰度数据，分析软件自动根据离子的飞行参数计算其 m/z，最终得 到蛋白的多价态质谱数据，并经解卷积化处理后获得蛋白的分子量。 5 试剂和材料 GB/T XXXXX—XXXX 5 水 符合 GB/T 6682 中实验用水一级水规格。 气体 氮气需干燥、无油，纯度不低于 95%，出口压力需与相应质谱仪适配，通常由氮气发生器提供；如 使用氩气应符合 GB/T 4842 中纯氩的标准。 试剂 甲酸、乙腈等试剂使用质谱级。质量轴校准试剂需与相应型号质谱仪适配。 标准物质 系统适用性标准品用于评估仪器的性能，需与相应型号质谱仪适配。 色谱柱 色谱柱所适用的流动相及流速需与质谱仪的离子源适配。 6 仪器 液相色谱仪 液相色谱仪由流动相传输系统、样品管理系统、带温控的色谱柱管理器组成。流动相传输系统可以 是四元混合或者二元混合；样品管理系统带温控并配备进样针清洗程序以避免交叉污染。 质谱仪 质谱仪包括离子源、离子聚焦系统、量分析器、检测器、真空系统和数据处理系统组成。 安装环境及仪器性能 为保证仪器测量结果稳定，安装环境温度应控制在 15-28℃，温度波动在 2℃以内；相对湿度必须 在 20%至 80%范围内，无冷凝。仪器在投入使用前，需使用校准试剂对质量轴进行校正，并使用系统适 用性标准品评估仪器的性能，确定仪器的灵敏度、分辨率及质量检测范围等指标。 7 样品处理 样品一般为水溶液，如其中含有无机盐、变性剂等对质谱有干扰的物质，应采用适宜的方式去除， 如超滤、透析