整体住发展精品
高效液相色谱整体柱技术的进展 鲍笑岭许旭 摘要:高效液相色谱整体柱(又名连续床)具有制备相对简单、原料易得以及聚合组分在一 定范围内可调节的优点,是近年来得到迅速发展的新型色谱柱。本文综述了目前高效液相色 谱(HPLC)制备整体柱的典型高聚物体系、制备各种整体柱时反应条件的影响,并简要介绍 了它的表征方法和应用。 关键词:整体柱,聚合物,高效液相色谱,评述 1引言 近年来,高效液相色谱整体柱作为一种新型色谱柱迅速发展起来。已有数家公司推出了商品 化的整体柱,例如无机硅骨架的整体柱Silica RODTM、Prep RODsTM和ChromolithTM, 有机聚合物整体柱CIMTMo有关这一-新技术的综述也有多篇,但其中讨论毛细管电色谱整 体柱的较多。 整体柱(monolithic column)又称整体固定相(monolithic stationary phase)x 棒柱(rod)> 连续 床(continuous bed)等,是在柱管内原位聚合或固定化了的连续整体多孔结构,可根据需要对 整体材料的表面作相应的衍生化,是一种新型的用于分离分析或作为反应器的多孔介质。通 过控制聚合条件来得到具有理想孔径分布的整体柱。整体柱中的空间由聚合物颗粒中的孔和 颗粒间的缝隙组成,分离在样品流经孔结构时发生。可以减少路径的差异和纵向扩展。虽然 早在1967年Kubin等尝试用聚2.羟乙基甲基丙烯酸酯凝胶制备分离蛋白质的低压排阻色谱 柱,但实用性的整体柱是1989年Hjerten首次报道的聚丙烯酰胺整体柱。整体柱的优点包括: 可以原位制备,省去制备填料和装柱,也可以同法制成聚合物颗粒后再装柱;聚合物易于制 备,柱子的长度和直径在一定程度上不受限制;聚合反应混合物中的单体可以灵活选择以得 到合适的基质和性质;易于在柱衍生化,以得到具有合适性质的色谱柱;通过控制聚合反应 的条件可以优化孔的性状。目前制备的整体柱分为无机和有机两大类:前者主要是将硅氧化 物直接烧结在柱内或者用溶胶-凝胶法在柱中反应得到,后者则是有机聚合单体在柱管内原 位聚合得到的。用作整体柱分离介质的多孔高聚物必须考虑其表面的化学性质、对溶剂和溶 质的保留、孔隙率、孔径分布和硬度这几方面的要求。整体柱可以用作高效液相色谱柱和毛 细管电色谱柱,本文主要讨论高效液相色谱整体柱的制备。而制备方法差异比较大的分了印 迹整体柱详见文献。 2整体柱材料 2.1无机整体柱 液相色谱中传统的填充柱常用硅胶作为填充基体材料,错、钛、铝的氧化物目前还不太 常用。近十几年发展起来的无机整体柱通常利用有机硅,如四甲氧基硅烷和四乙氧基硅烷, 在酷酸水溶液中水解,随后在制孔剂(如聚乙二附)存在下制得具有孔洞结构的整体硅胶柱。 它比传统的填充柱有更大的孔和更好的渗透性,可以在较高的流速下保持较低的压力。 Minakuchi等首先将溶胶-凝胶法应用于硅胶整体柱的制备,其步骤是:四甲氧基硅烷的 水解(有酸水解和碱水解两神);水解的硅四面体结合,形成Si-O-Si键;高温老化(一般不小 于600°C),使聚合反应完全、骨架坚硬。利用溶胶-凝胶法制备硅整体柱的难点是整体材料 在聚合过程中会收缩。因此,在模具中先制得的整体硅胶柱要截成适当长度装到聚四氟乙烯 的柱管中。为了保证柱了准直,通常内径小于10mm,柱长不超过15cm。聚四氟乙烯包裹 的柱子可以耐受高达120 kg/Cm2的压力。整体材料在模具中聚合时,因为同时存在整个网 状结构收缩,得到流通孔径/骨架尺寸比为1.2〜1.5,而填充柱中该值为0.25〜0.4。 整体硅胶材料和有机整体材料一样,可通过化学修饰或改变原料(使用不同性质的聚合 单体)获得不同用途的整体柱。整体硅胶基质表面的硅羟基是化学修饰的靶点。Minakuchi 等用十八烷基二甲基・(N, N.二乙基胺基)硅烷与硅羟基反应得到用于反相高效液相的C18- 整体硅柱。McCallcy比较了传统的填充柱与Merck公司反相整体硅胶柱分离中性和碱性化 合物的情况。实验显示,高流速分离中性样品时,整体柱的理论塔板高度小于5呻 填料填 充的色谱柱;酸性条件室温下高流速分离弱碱性和强碱性样品时,板高仍低于填充柱,但拖 尾明显;整体柱在流动相pH为7时,分离强碱性样品的峰形更差。柱温升高会提高溶质在 流动相中的扩散系数(Dm)而提高柱效oMassolin等采用Merck公司的整体硅胶疑基柱,以N, N,.二琥珀酰亚胺碳酸酯为连接臂,制备了青霉素酰基转移酶的酶反应器,并用它研究了 2- 芳氧基脂肪酸甲酯及其类似物的在线酶催化不对称反应和分离。 2.2有机聚合物整体柱 2.2.1丙烯酰胺类的整体材料聚丙烯酰胺体系是典型的水相聚合体系,也有在有机相 聚合的报道。其特点是:单体易溶于水;有良好的生物兼容性,适合分离生物大分子;柱中 的凝胶颗粒上没有孔•来增加传质,但其直径小,表面粗糙,所以表面积大,结合位点多;凝 胶颗粒间靠共价键结合,流动阻力小;可通过压紧柱了降低孔体积来提高分离效果;分离效 果往往随流速的提高而提高,表明因扩散造成的区带展宽减小了。Hjerten等最先利用这一 体系制备整体柱。制备聚丙烯酰胺整体柱时,交联剂的比例较高,还要加入硫酸铉以促使相 分腐,产生供流动相流过的流通孔。1994年,Hjerten等对交联聚丙烯酰胺整体柱中流通孔 的性质如何受聚合反应条件的影响进行了研究。以甲基丙烯酰胺为单体,哌嗪二丙烯酰胺为 交联剂(T=15%, C=55.9%),以硫酸铉作为致孔剂在磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中聚合。聚合引发 剂为过硫酸铉(APS),加速剂为N, N, N,, V-四甲基乙二胺(TEMED)o实验显示:温度、 缓冲液种类、弓1发剂和加速剂的浓度,以及致孔剂的浓度都会影响孔径的分布。研究发现, 单体总浓度(T)高于35%(m/V)时连续床(整体柱)就开始丧失其机械强度,并导致极高的流动 阻力。通过降低引发剂和加速剂(如APS和TEMED)仙浓度来增加聚合物的链长,可以部分 克服这个不足。增加硫酸铉的浓度可以进一步降低流动阻力,它在单体混合物中的作用是通 过增加生成的聚合物链之间的疏水相互作用而在凝胶基质中形成流通孔。水相聚合的聚丙烯 酰胺质地软,且孔径分布范围较大。高流速的冲洗可以将柱了压紧(柱的最终长度大约只有 原来的1/10〜1/15),部分提高机械强度,并减小孔径分布从而提高柱效。聚合物溶液中加 入丙烯酸可以得到阳离子交换色谱柱;加入N.烯丙基二甲基胺可以得到阴离子交换柱, 35mm长的阴离了交换柱可以在lOmin内分离5种蛋白质,并且分离效果不受流速的影响。 细内径阴离了交换柱(70mmX0.3mm)在30min内能完全分离肌红蛋白、核糖核酸酶A、卵 白蛋白、a-糜蛋白前原、A, R■藻红蛋白5种蛋白质;加入丙烯酸丁酯则可得到疏水相互作 用色谱(HIC)柱。Frcchc等将单体(丙烯酰胺和甲又双丙烯酰胺)溶解于二甲亚砚和醇的混合物 中,无须压柱即可一步制得坚硬的整体材料。当然,水溶性APS的必须以油溶性的自由基 引发剂偶氮二异丁腊(AIBN)代替。作者将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺(Bis)于50°C溶于 DMSO与醇的混合物中