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(完整)质粒提取方法及步骤(精) ( (完整完整) )质粒提取方法及步骤质粒提取方法及步骤( (精精) ) 编辑整理： 尊敬的读者朋友们： 这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们 对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（ (完整)质粒提取方法及步骤 (精)）的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我 们进步的源泉，前进的动力。 本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以 下为(完整)质粒提取方法及步骤(精)的全部内容。 (完整)质粒提取方法及步骤(精) 质粒提取方法及步骤 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常 规技术可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的 优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少追其原因，我想大概是因为分子克隆里 面只讲实验操作步骤,而没有对原理进行详细的论述这是导致我的学生误入歧途的主 要原因后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多 老师也是这个状态这就不得不让人感到悲哀了 我想这恐怕和我们的文化有点关系中国人崇尚读书，学而优则仕的观念深入人心 经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了所以这读书的定义 就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分这就是现代科学没有在中国萌发 的根本原因如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根 的，它只能蜕化成新的八股学生命科学是实验科学，它讲究动手如果实验科学只要 看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师 的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考,不就成了一个工匠?一个合格的生命科学研 究者，需要在这两方面完善自己一个杰出的科学工作者,是一个熟知科学原理并善于 应用的艺术家每个曾经用碱法抽提过质粒的同学,希望你看本文后能有所思考，让中 国的未来有希望 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液 I ，50 mM 葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0; 溶液 II ,0。2 N NaOH / 1% SDS； 溶液 III ,3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸 让我们先来看看溶液 I 的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH ，因 此用适当浓度的和适当 pH 值的 Tris—Cl 溶液，是再自然不过的了那么 50 mM 葡萄 糖是干什么的呢?说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌 不会快速沉积到管子的底部因此，如果溶液I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身 而言，几乎没有任何影响所以说溶液 I 中葡萄糖是可缺的那么 EDTA 呢?大家知道 EDTA 是 Ca2+和 Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用 是：抑制 DNase 的活性，和抑制微生物生长在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA ， 无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉如果不加EDTA ,其实也 (完整)质粒提取方法及步骤(精) 没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提,就不用怕 DNA 会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE 缓冲液中有 EDTA 如果哪天你手上正好 缺了溶液 I ，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB 培养 基来悬浮菌体就可以了有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块 轮到溶液 II 了这是用新鲜的 0。4 N 的 NaOH 和 2％的 SDS 等体积混合后使用的 要新从浓 NaOH 稀释制备 0。4N 的 NaOH ，无非是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2 而减弱了碱性很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS ，所以才叫碱 法抽提事实上 NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞， 碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结 构向 micelle （微囊）结构的相变化所导致用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到 质粒如果只用 SDS 当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS 也是碱性的，只是弱了点而已很多人对NaOH 的作用误以为是为了让基因组 DNA 变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA 变性复性的描述所导 致有人不禁要问,既然是 NaOH 溶解的细胞，那为什么要加 SDS 呢？那是为下一步操 作做的铺垫这一步要记住两点:第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因 为在这样的碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待 女孩子一样），不然基因组 DNA 也会断裂基因组 DNA 的断裂会带来麻烦，后面我再 详细说明 每个人都知道,溶液 III 加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀 的本质最容易产生的误解是，当 SDS 碰到酸性后发生的沉淀如果你这样怀疑，往 1％ 的 SDS 溶液中加如 2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了大量沉淀的出现,显然 与 SDS 的加入有关系如果在溶液 II 中不加 SDS 会怎样呢，也会有少量的沉淀,但量 上要少得多,显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质既然 SDS 不是遇酸发生的沉淀， 那会不会是遇盐发生的沉淀呢?在 1％的 SDS 溶液中慢慢加入 5 N 的 NaCl ，你会发 现 SDS 在高盐浓度下是会产生沉淀的因此高浓度的盐导致了SDS 的沉淀但如果你加 入的不是 NaCl 而是 KCl ，你会发现沉淀的量要多的多这其实是十二烷基硫酸钠 （sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而 PDS 是水不溶的,因此发生了沉淀如此看来，溶液 III 加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的钠离子形成了不溶性的 PDS ,而高浓 度的盐，使得沉淀更完全大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上 (完整)质粒提取方法及步骤(精) 结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀 了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了这个过程不难想象,因为 基因组 DNA 太长了，长长的 DNA 自然容易被 PDS 给共沉淀了，尽管 SDS 并不与 DNA 分子结合 那么 2 M 的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和 NaOH ，因为长时间的碱性条 件会打断 DNA ,所以要中和之基因组 DNA 一旦发生断裂，只要是 50－100 kb 大小的 片断,就没有办法再被 PDS 共沉淀了所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡，不 然最后得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA 混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓 浓的总 DNA 条带很多人误认为是溶液 III 加入后基因组 DNA 无法快速复性就被沉淀 了，这是