淀粉酶的提取要点

。 αα- -淀粉酶的提取、分离及测定淀粉酶的提取、分离及测定 （生化试验小组-2005.4） 试验全程安排：试验全程安排： 样品的粗处理及粗分离，包括： 1） 样品处理 2） 离子交换色谱分离 第一天 3） 紫外检测（紫外测定蛋白） ，绘出色谱图 4） 收集样品 对各峰收集样品进行分析，包括： 1） 精确测定蛋白含量（Folin-酚） 第二天2） 测定酶活 3） 比活计算 对活性峰及原液进行分析及鉴定，包括： 1） SDS－PAGE 分析（分子量分析） 第三天 2） 纯化倍数计算等 试验一、色谱分离淀粉酶试验一、色谱分离淀粉酶 1.11.1 试剂及设备试剂及设备 离子交换树脂 -20℃冰箱 样品管（5-10ml 试管） 1.5ml 离心管 紫外分光光度计 α-淀粉酶样品 秒表 胶头吸管（进样用） 平衡缓冲液（pH8.0，0.01M 磷酸盐缓冲液） 洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M 的氯化钠） 试剂瓶 1.21.2 离子交换色谱原理与方法离子交换色谱原理与方法 色谱(chromatography)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。20世纪 初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中， 植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色， 这样就 可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。到1907年茨维特的论文用俄文公开发 表， 他把这种方法命名为chromatography, 即中文的色谱， 这就是现代色谱这一名词的来源。 -可编辑修改- 。 但由于茨维特当时没有知名度， 而且能看懂俄文的人也不多， 加之很快爆发了第一次世界大 战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。 20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方 法对植物提取物进行分离， 色谱方法才被广泛地应用。 自20世纪40年代以来以Martin为首的 化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理 论方法， 马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。 20世纪50 年代以后由于战后重建和经济发展的需要， 化学工业特别是石油化工得到广泛的发展， 亟需 建立快速方便有效的石化成分分析。 而石化成分十分复杂， 结构十分相似，且多数成分熔点 又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。同样，石化工业 的发展也使色谱技术特别是气相色谱得到广泛的应用。 气相色谱的仪器也不断得到改进和完 善，气相色谱逐渐成为一种工业分析必不可少的手段和工具。 20世纪80年代以后我国也大规模采用气相色谱和高效液相色谱。随着环境科学的发展， 不仅需要对大量有机物质进行分离和检测，而且也要求对大量无机离子进行分离和分析。 1975年美国Dow化学公司的H.Small等人首先提出了离子交换分离抑制电导检测分析思维即 提出了离子色谱这一概念离子。色谱概念一经提出便立即被商品化产业化由Dow公司组建的 Dionex公司最早生产离子色谱并申请了专利。我国从20世纪80年代开始引进离子色谱仪器， 在我国八五、 九五科技攻关项目中均列有离子色谱国产化的项目， 对其进行了重点技术攻关。 色谱的分类 色谱的分类有多种，主要按两相的状态及应用领域的不同可分为两大类 1.按应用领域不同分类 制备色谱 半制备色谱 2.以流动相和固定相的状态分类 气相色谱、气固色谱、气液色谱、液相色谱、液固 色谱、液液色谱、超临界色谱、毛细管电泳 离子交换色谱 离子色谱分离主要是应用离子交换的原理，采用低交换容量的离子交换树脂来分离离 子。它在离子色谱中应用最广泛， 其主要填料类型为有机离子交换树脂， 以苯乙烯二乙烯苯 共聚体为骨架在苯环上引入磺酸基形成强酸型阳离子交换树脂， 引入叔胺基而成季胺型强碱 性阴离子交换树脂，此交换树脂具有大孔或薄壳型或多孔表面层型的物理结构以便于快速 达到交换平衡。离子交换树脂耐酸碱，可在任何pH 范围内使用，易再生处理，使用寿命长。 缺点是机械强度差，易溶胀，易受有机物污染。 离子色谱基本流程图如下图所示： -可编辑修改- 。 离子交换的分类及常见种类 （一）分类 离子交换剂分为两大类，即阳离子交换剂和阴离子交换剂。各类交换剂根据其解离性大小， 还可分为强、 弱两种， 即 强酸剂阳离子交换剂弱酸剂强硷型阴离子交换剂弱硷 型 。 1.阳离子交换剂 阳离子交换剂中的可解离基因是磺酸（-SO3H） 、磷酸（-PO3H2） 、 羧酸（COOH）和酚羟 基（-OH）等酸性基。 某些交换剂在交换时反应如下： 强酸性：R-SO3 -H+ ＋ Na+ R-SO3- Na+H+ 弱酸性：R-COOH＋Na+ R-COONa ＋H+ 国产树脂中强酸 17（上海树脂＃732）和国外产品 Dowex 50、Zerolit 225 等都于 强酸型离子交换剂。 2.阴离子交换剂 阴离子交换剂中的可解离基因是伯胺、 （-NH2） 、仲胺（-NHCH3） 、叔胺[N-（CH3）2]和 季胺[-N（CH3）2]等硷性基团。某些交换反应如下： 强硷性：R-N+（CH3）2 HOH- ＋Cl R-N+（CH3）2 Cl＋OH- 弱硷性：R-N+（CH3）2 HOH- ＋Cl R-N+（CH3）2 HCl＋OH- 强硷性＃201 号国产树脂和国外 Dowex1、 Dowex2、 ZerolitFF 等都属于强硷型阴离子交换剂。 （二）种类 1.纤维素离子交换剂：阳离子交换剂有羟甲基纤维素（CM-纤维素） ， 阴离子交换剂有氯代 三乙胺纤维纱（DESE-纤维素） 。 2.交联葡聚糖离子交换剂： 是将交换基因连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂， 因而既具 有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱分离物质。常用的Sephadex 离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂有DEAE-Sephadex A-25，A-50 和 QAE- Sephadex A25 ， A50 ；阳离子交换剂有 CM-Sephaetx C-50， C-50 和 Sephadex C-25， C-50。阴离子交换剂用英文字头A，阳离子交换剂的英文字头是C。英文字后面的数字表示 Sephadex 型号。 3.琼脂糖离子离交换剂：是将DESE-或 CM-基团附着在 Sepharose CL-6B 上形成， DEAE-Sephades（阴离子）和CM-Sepharose（阳离子） ，具有硬度大， 性质稳定，凝胶后的 流速好，分离能力强等优点。 交换剂的处理，再生与转型 新出厂的树脂是干树脂， 要用水浸透使之充分吸水膨胀。 因其含有政绩一些杂质， 所要 要用水、酸、硷洗涤。一般手续如下： 1. 新出厂干树脂用水浸泡 2 小时后减抽压去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清， 去水 2. 加 4 倍量 0.1-2N HCl 搅抖 4 小时，除去酸液，水洗到中性 3. 再加 4 倍量 0.1-2N NaOH 搅抖 4 小时，除硷液， 水洗到中性备用。 4. 将树脂带上所希望的某种离子的操作称为转型。如希望阳树脂带Na+，则用4 倍量 NaOH