浅谈对实时荧光定量PCR技术的理解

浅谈对实时荧光定量 PCR 技术的理解 实时荧光定量 PCR(Real time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR)是一种实 时监控 DNA 扩增反应的技术。在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号 积累进行实时监测整个 PCR 过程，并将 DNA 的累积速率绘制成动态变化图，在 扩增的指数期对起始模板进行定量， 从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异 系数的问题。该项技术于 1996年由美国Applied Biosystems 公司推出，促使 PCR 技术从定性到定量的飞跃，而且集特异性强、自动化程度高、灵敏度好、污染少 等优点为一体，现已在生物研究、医药、食品等领域得到广泛应用。 1 1 RT-qPCRRT-qPCR 的基本原理和应用的基本原理和应用 1.1 基本原理 RT-qPCR 的分类方法根据其化学原理可分为探针类和非探针类两种 , 下面 以 TaqMan探针类和 SYBR GreenⅠ非探针类两种常见方法简述其原理。 1.1.11.1.1 TaqMan 探针法 TaqMan探针是一种长度为 20-24bp 寡核苷酸探针， 在其 5′末端标记一个荧 光报告基团(reporter,R)， 在 3′末端则标记一个荧光淬灭基团。PCR 扩增时在加 入一对引物的同时加入 TaqMan荧光探针,其结合位点在两条引物之间,只与模板 特异地结合。 当完整的探针与目标序列杂交时,荧光基团发射的荧光信号与 3′端 的淬灭剂接近而被淬灭。 但在进行延伸反应时,聚合酶的 5′外切酶活性将探针进 行酶切,将 DNA 探针逐个降解，使得荧光基团与淬灭剂分离。这样 PCR 体系中荧 光的强度与 PCR 产物量之间呈正比,可通过测定荧光强度而对 PCR 产物定量。 如下图 1-1 至图 1-11 所示为 TaqMan探针工作原理简图： 1 激发光 激发光 淬灭基团 能量 荧光共振能量转移，FRET 图检测不到报告荧光1-2 完整的探针， 1-1 切断的探针，检测到报告荧光图 2 图 1-3 变性 图 1-4 退火 具有 5′-3′外切酶活性 图 1-5 延伸（1） 5′-3′外切酶活性 图 1-6 延伸（2） 图 1-7 延伸（3） 图 1-8 延伸（4）图 1-9 延伸（5） 图 1-10 延伸（6） 报告基团和淬灭基团 分离而发光 图 1-11 延伸（7） 1.1.21.1.2 SYBR GreenⅠ染料法 SYBR GreenⅠ荧光染料是一种非饱和菁类荧光素， 可以嵌合于 DNA 双链的小 沟区域，其最大吸收波长约为 497nm，发射波长最大约为 520nm。特异性地掺 入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧 光信号。 因此， 根据荧光信号检测出 PCR 体系中存在的双链 DNA 数量。 如图 1-12 和图 1-13 为 SYBR GreenⅠ工作原理简图: 图 1-12SYBR 染料处于游离状态 3 图 1-13SYBR 染料与双链 DNA 分子结合 1.1.31.1.3 两种方法的优缺点 总而言之，探针类是利用与靶序列特异性结合的探针来指示扩增产物的增加， 非探针类则是利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。 前者由于 增加了探针的识别步骤，特异性更高，但价格昂贵。后者可以与所有的双链 DNA 相结合,因此设计的程序通用性好,且价格相对较低，更简便易行。 特别地，由于 SYBR Green I 与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、 单链二级结构及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。 可以通过测 量升高温度后荧光的变化帮助降低非特异产物的影响， 由解链曲线来分析产物的 均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到的定量结果。 1.2 RT-qPCR 技术的主要应用 1.2.11.2.1 医学领域 RT－qPCR 技术目前应用最为广泛的是医学领域，包括病原体的检测，例如 病毒、细菌、病原体的定量监测及治疗药效评价；基因的点突变及单核苷酸多态 性（SNP）分析；临床疾病的诊断，如各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病 诊断，肿瘤基因的检测和诊断等。 1.2.21.2.2 植物中的应用 RT－qPCR 技术是一种很好的检测基因表达的方法，通过 RT－qPCR 可以分 析植物在不同处理条件下基因样本的表达差异， 也可以分析植物在不同生长发育 时期基因表达的差异。 该项技术的应用对植物病理学研究和植物遗传育种研究起 到了推进作用。 1.2.31.2.3 食品安全 应用 RT－qPCR 技术对食品中的微生物进行检测和研究，不仅可以对活体 微生物核酸量进行检测，还可以对已死的生物进行检测。该项技术的应用也使得 转基因食品的检测突破了从定性到定量的界限。 1.2.41.2.4 其他科学研究 此外， RT－qPCR 技术在其他分子生物学相关定量研究领域的应用也取得了 较大进展，如：在动植物基因工程、微生物鉴定与分类、昆虫分类和鉴定中的应 4 用及昆虫检疫等。 2 2 一般实验步骤一般实验步骤 在进行实时荧光定量 PCR 前，主要有 RNA 样品抽提、RNA 质量检测、样品 cDNA 的合成，引物设计合成及其他药品购买，选择合适的荧光定量方法等。在 正式试验前需进行验证实验，以确定扩增效率（一般大于 1.9 为有效） 、动力学 范围，确保准确度、精密度。接着需要做的有：梯度稀释的标准品及待测样品的 管家基因（β-actin）实时定量PCR 、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA 模 板、待测样品的待测基因实时定量 PCR 、电泳检测 PCR 产物是否为单一特异性 扩增条带及数据分析。 特别地， 学院现有的 7500 型实时荧光定量 PCR 仪可同时实现特异性靶基因 检测与定量。7500 型实时荧光定量 PCR 仪采用 96 孔反应板或单个及 8 联管，反 应体积 25-100ul。该仪器将 PCR 热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一 起，可以动态观察PCR 每一循环各反应管中 PCR 扩增产物逐渐增加的情况。PCR 实验结束后可以马上得到定量结果，无需凝胶电泳分析和 PCR 产物纯化。 3 3 常见问题分析常见问题分析 3.1 如何甄别可疑的扩增 根据电脑自动给出的标准曲线，确定样品所含的目的 DNA 初始量时，标准 曲线的相关性应该不小于 95%。同一样品的 3 个平行反应所得出的 Ct 值之间的 差值不应大于 0. 5。 甄别可疑扩增还可以通过这三方面来判别，看扩增曲线的形状，正确的扩 增一般有明显扩增阶段（特别是指数增长期） ，所有的曲线有较好平行性。查看 Y 轴的数值， “可疑”曲线的指数增长期范围常常是落在1e-2 的范围内。看线性 图，曲线没有明显的上升趋势则提示不存在正确扩增。 3.2 试验重复的问题 一般来说，为了减少加样以及实验系统的误差，每一次实验内包含两个生 物学重复，即处理同样的东西两份，也有两个相应的对照。所以一般直接取平均 值，若出现一个数值偏差，则去除离群值，取剩下的两个值平均。若三个值分散 都太大，则说明实验操作可能存在问题，需要重新实验。 5