发酵工艺综合实习指导书模板
目 录 综合试验一 土壤中稀有放线菌分离和纯化 及抗生菌体外抗菌判定 综合试验二 玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵 综合试验三 甜酒酿造 综合试验一 土壤中稀有放线菌分离和纯化 及抗生菌体外抗菌判定 一 土壤中稀有放线菌分离和纯化 1 试验目标 了解采集土样要求和方法,掌握由土壤中分离稀有放线菌基础原理和操作技术,学习并掌握土壤稀释法和微生物纯培养技术。 2 试验原理 筛选放线菌是新抗研究关键课题之一。迄今为止,已发觉抗生素有80%皆来自于放线菌。放线菌关键存在于土壤中,并在土壤中占有相当大百分比。通常地,放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富土壤中数量居多。通常,伴随地理分布、植被及土壤性质不一样,放线菌种类、数量和拮抗性也各不相同。 土壤是微生物大本营,其中放线菌多以链霉菌为主,所以大家通常将除链霉菌以外其它放线菌统称为稀有放线菌。若以常规方法进行分离,得到几乎全部是链霉菌。然而,当采取加热处理土样、选择特殊培养基或添加某种抗生素等方法时,均可提升稀有放线菌取得率。 由土壤中分离放线菌方法很多,其中包含稀释法、弹土法、混土法和喷土法等,本试验关键采取稀释法,并经过选择特殊培养基方法,来取得少许稀有放线菌。 3 仪器和材料 (1)培养基:葡萄糖天门冬素琼脂,精氨酸琼脂,高氏1号琼脂,以上每种培养基皆用500ml三角瓶分装250ml。 (2)灭菌物品:牛皮纸袋,培养皿,1ml、5ml吸管,250ml三角瓶分装90ml无菌水(含30粒玻璃珠),18×180mm试管分装9ml无菌水,牙签,玻璃刮铲,18×180mm试管中分装10 ml 1‰K2Cr2O7母液。 (3)其它:采土铲,细目筛,药勺,称量纸,试管架,小天平,记号笔。 4 试验步骤 (1)采土:选择适宜采样地点。用采土铲去除表土,取5~10cm深处土壤约150g左右,装入无菌牛皮纸袋中,并注明采样日期、地点、土壤类型、植被和采样人姓名等。 (2)土样预处理:新鲜土样应合适风干,并喷施小剂量杀虫剂以防培养过程中虫卵发育影响。 (3)制备平板:每组取10套无菌培养皿,将冷却至50℃左右各培养基,分别倒入平皿,每皿约15~20ml。每种培养基中需加入20ppmK2Cr2O7溶液。在皿盖上注明培养基种类及组号。 (4)制备土壤稀释液:每组称取10g土样,放入90ml无菌水中,得到土壤原液。手摇15~20min后,静置1min。再用无菌吸管取1ml上清液,置于9ml无菌水中,充足混匀,则得到10-2稀释液。依这类推,制备10-3、10-4稀释液(通常地,较肥土壤使用10-3~10-5稀释液,而瘦土则使用10-2~10-4稀释液)。 (5)铺平板:用1ml无菌吸管分别取0.1ml 10-3~10-5稀释液,置于培养基平板中央。然后,再用无菌玻璃刮铲均匀涂布,静置10min。每1稀释度3个反复,每1种培养基10套平板。并注明各稀释度。 (6)培养及观察:将各平板置于28℃恒温箱中倒置培养14天。要求分别在第2天、7天和14天进行观察,并依据菌落大小、气生菌丝有没有、气生菌丝和基质菌丝颜色及可溶性色素有没有等培养特征,选择单菌落放线菌进行纯培养,同时在平板后面对应位置上作好标识。 (7)纯培养:立即将选定单菌落接入高氏1号琼脂斜面,每个菌株接1支斜面。必需时,中间可加1次划线分离培养,然后再转斜面。 5 结果和讨论 将试验结果填入下表。 思索题 1、在分离土壤放线菌时为何要选择多个培养基? 2、在培养基中添加K2Cr2O7有何作用? 二 抗生菌体外判别 1 试验目标 了解抗生素产生菌体外筛选法原理,学习并掌握抗生菌判别方法。 2 试验原理 由土壤中分出放线菌需深入判别是否为需要抗生菌。首先应依据筛选目标确定试验模型,然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常见方法有琼脂块法和滤纸片法。其关键依据是扩散原理,即观察在抗生菌周围是否会出现显著抑菌圈。抑菌圈大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性强弱。本试验选择了这两种方法。 3 仪器和材料 (1)培养基:500ml三角瓶中分装300ml黄豆饼粉琼脂,18×180mm试管分装4ml黄豆饼粉浸汁,300ml三角瓶分装150ml细菌培养基,150ml三角瓶分装50ml马铃薯培养基。 (2)试验菌: 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 大肠杆菌(Escherichia coli) 金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus) 深红酵母(Ruodotorula rubra) (3)待测菌株: 琼脂培养物:将融化黄豆饼粉琼脂倒入无菌培养皿,制成平板。用记号笔在平皿后面画一直线,将平皿一分为二,分别注明待测菌株编号。并根据编号将待测菌株密集划线接入平板。同法接入华美链霉菌(Streptomyces splendens)和金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)作为对照菌,28℃下培养7天 发酵液:将待测菌株和对照菌分别接入黄豆饼粉培养液,作好标识,28℃下振荡培养7天。 (4)灭菌物品:培养皿,打孔器,镊子,圆滤纸片,15×150mm试管分装5ml无菌水,1ml吸管,无菌漏斗。 (5)其它:接种用具,游标卡尺,记号笔,摇床。 4 试验方法 4.1 琼脂块法 (1)分别取枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各1支,加入5ml无菌水 制成菌悬液,备用。 (2)取9套无菌培养皿,向每套培养皿中分别加入1ml试验菌悬液,然后加入约12ml冷却至45℃左右细菌培养基,快速在试验台上摇匀,制成指示菌平板。每1种指示菌3个反复,并注明指示菌及测定菌株位置。 (3)用无菌打孔器将待测菌株和对照菌黄豆饼粉琼脂培养物切块,每种培养物9块。 (4)用无菌接种针,将待测菌株和对照菌琼脂块分别移入各指示菌平板对应位置上,菌面朝上,间隔均匀摆放。 (5)静置20min后,放入恒温箱,37℃下培养18~24h。 (6)用游标卡尺测量抑菌圈直径,并观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度。 4.2 滤纸片法 (1) 向深红酵母菌斜面中加入5ml无菌水,制成菌悬液。 (2) 向已冷却至45℃左右马铃薯培养基中加入0.5ml深红酵母菌悬液,摇匀后,倒3个指示菌平板,并在平皿后面标明测定菌株位置,备用。 (3)过滤各测定菌株发酵液。 (4) 用无菌镊子取无菌圆滤纸片,蘸取各测定菌株发酵滤液,放入指示菌平 板对应位置上,每1测定菌株3个反复。 (5) 静置20min后,28℃下培养2天。 (6) 用游标卡尺测量抑菌圈直径,并观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度。 5 结果 将试验所得结果填入下表,抑菌圈直径以mm来表示。 思索题 1、为何在移入琼脂块和滤纸片后不立即保温培养? 2、抑菌圈小是否就意味着菌株抑菌活性差?为何? 试验进度安排