发酵工艺综合实习指导书模板

目 录 综合试验一 土壤中稀有放线菌分离和纯化 及抗生菌体外抗菌判定 综合试验二 玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵 综合试验三 甜酒酿造 综合试验一 土壤中稀有放线菌分离和纯化 及抗生菌体外抗菌判定 一 土壤中稀有放线菌分离和纯化 1 试验目标 了解采集土样要求和方法，掌握由土壤中分离稀有放线菌基础原理和操作技术，学习并掌握土壤稀释法和微生物纯培养技术。 2 试验原理 筛选放线菌是新抗研究关键课题之一。迄今为止，已发觉抗生素有80皆来自于放线菌。放线菌关键存在于土壤中，并在土壤中占有相当大百分比。通常地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富土壤中数量居多。通常，伴随地理分布、植被及土壤性质不一样，放线菌种类、数量和拮抗性也各不相同。 土壤是微生物大本营，其中放线菌多以链霉菌为主，所以大家通常将除链霉菌以外其它放线菌统称为稀有放线菌。若以常规方法进行分离，得到几乎全部是链霉菌。然而，当采取加热处理土样、选择特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提升稀有放线菌取得率。 由土壤中分离放线菌方法很多，其中包含稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本试验关键采取稀释法，并经过选择特殊培养基方法，来取得少许稀有放线菌。 3 仪器和材料 （1）培养基葡萄糖天门冬素琼脂，精氨酸琼脂，高氏1号琼脂，以上每种培养基皆用500ml三角瓶分装250ml。 （2）灭菌物品牛皮纸袋，培养皿，1ml、5ml吸管，250ml三角瓶分装90ml无菌水（含30粒玻璃珠），18180mm试管分装9ml无菌水，牙签，玻璃刮铲，18180mm试管中分装10 ml 1‰K2Cr2O7母液。 （3）其它采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔。 4 试验步骤 （1）采土选择适宜采样地点。用采土铲去除表土，取5～10cm深处土壤约150g左右，装入无菌牛皮纸袋中，并注明采样日期、地点、土壤类型、植被和采样人姓名等。 （2）土样预处理新鲜土样应合适风干，并喷施小剂量杀虫剂以防培养过程中虫卵发育影响。 （3）制备平板每组取10套无菌培养皿，将冷却至50℃左右各培养基，分别倒入平皿，每皿约15～20ml。每种培养基中需加入20ppmK2Cr2O7溶液。在皿盖上注明培养基种类及组号。 （4）制备土壤稀释液每组称取10g土样，放入90ml无菌水中，得到土壤原液。手摇15～20min后，静置1min。再用无菌吸管取1ml上清液，置于9ml无菌水中，充足混匀，则得到10－2稀释液。依这类推，制备10－3、10－4稀释液（通常地，较肥土壤使用10－3～10－5稀释液，而瘦土则使用10－2～10－4稀释液）。 （5）铺平板用1ml无菌吸管分别取0.1ml 10－3～10－5稀释液，置于培养基平板中央。然后，再用无菌玻璃刮铲均匀涂布，静置10min。每1稀释度3个反复，每1种培养基10套平板。并注明各稀释度。 （6）培养及观察将各平板置于28℃恒温箱中倒置培养14天。要求分别在第2天、7天和14天进行观察，并依据菌落大小、气生菌丝有没有、气生菌丝和基质菌丝颜色及可溶性色素有没有等培养特征，选择单菌落放线菌进行纯培养，同时在平板后面对应位置上作好标识。 （7）纯培养立即将选定单菌落接入高氏1号琼脂斜面，每个菌株接1支斜面。必需时，中间可加1次划线分离培养，然后再转斜面。 5 结果和讨论 将试验结果填入下表。 思索题 1、在分离土壤放线菌时为何要选择多个培养基 2、在培养基中添加K2Cr2O7有何作用 二 抗生菌体外判别 1 试验目标 了解抗生素产生菌体外筛选法原理，学习并掌握抗生菌判别方法。 2 试验原理 由土壤中分出放线菌需深入判别是否为需要抗生菌。首先应依据筛选目标确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常见方法有琼脂块法和滤纸片法。其关键依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现显著抑菌圈。抑菌圈大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性强弱。本试验选择了这两种方法。 3 仪器和材料 （1）培养基500ml三角瓶中分装300ml黄豆饼粉琼脂，18180mm试管分装4ml黄豆饼粉浸汁，300ml三角瓶分装150ml细菌培养基，150ml三角瓶分装50ml马铃薯培养基。 （2）试验菌 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 大肠杆菌（Escherichia coli） 金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus） 深红酵母（Ruodotorula rubra） （3）待测菌株 琼脂培养物将融化黄豆饼粉琼脂倒入无菌培养皿，制成平板。用记号笔在平皿后面画一直线，将平皿一分为二，分别注明待测菌株编号。并根据编号将待测菌株密集划线接入平板。同法接入华美链霉菌（Streptomyces splendens）和金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）作为对照菌，28℃下培养7天 发酵液将待测菌株和对照菌分别接入黄豆饼粉培养液，作好标识，28℃下振荡培养7天。 （4）灭菌物品培养皿，打孔器，镊子，圆滤纸片，15150mm试管分装5ml无菌水，1ml吸管，无菌漏斗。 （5）其它接种用具，游标卡尺，记号笔，摇床。 4 试验方法 4.1 琼脂块法 （1）分别取枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各1支，加入5ml无菌水 制成菌悬液，备用。 （2）取9套无菌培养皿，向每套培养皿中分别加入1ml试验菌悬液，然后加入约12ml冷却至45℃左右细菌培养基，快速在试验台上摇匀，制成指示菌平板。每1种指示菌3个反复，并注明指示菌及测定菌株位置。 （3）用无菌打孔器将待测菌株和对照菌黄豆饼粉琼脂培养物切块，每种培养物9块。 （4）用无菌接种针，将待测菌株和对照菌琼脂块分别移入各指示菌平板对应位置上，菌面朝上，间隔均匀摆放。 （5）静置20min后，放入恒温箱，37℃下培养18～24h。 （6）用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度。 4.2 滤纸片法 1 向深红酵母菌斜面中加入5ml无菌水，制成菌悬液。 2 向已冷却至45℃左右马铃薯培养基中加入0.5ml深红酵母菌悬液，摇匀后，倒3个指示菌平板，并在平皿后面标明测定菌株位置，备用。 3过滤各测定菌株发酵液。 4 用无菌镊子取无菌圆滤纸片，蘸取各测定菌株发酵滤液，放入指示菌平 板对应位置上，每1测定菌株3个反复。 5 静置20min后，28℃下培养2天。 6 用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度。 5 结果 将试验所得结果填入下表，抑菌圈直径以mm来表示。 思索题 1、为何在移入琼脂块和滤纸片后不立即保温培养 2、抑菌圈小是否就意味着菌株抑菌活性差为何 试验进度安排