从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌试验方案

土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀 粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述：一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、 植物和动物体中。它们将淀粉及相关 的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是 最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多, 特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废 料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、 发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【 】 究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。 其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有： 地衣芽 【 】【 】 孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、 产生抗逆性内生抱子的杆状细菌， 许多为腐生菌，主要分布于土壤 【 】 和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活 动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在 土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm 的 【 】 土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯 化。 平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。 其基本原理是选择适合与待分离微生物的生 长条件，如营养成分、酸碱度、 温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生 长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培 养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外， 还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确 定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP 试验阳性；不产 生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长 温度大约从 25℃到 75℃以上；最低生长温度大约5℃到 45℃；生长最低pH 值，从7.5—8 到 2 左右；耐盐范围从低于2%的 NaCl 到 25%NaCl；营养明胶（ 22℃）7 天内液化 1 厘米 或 1 厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代 1 替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的， 但含有葡萄糖、柠檬酸盐和 【 】。 一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源6 细菌特性 1. 繁殖快速:代谢快、繁殖快，四小时增殖10 万倍，标准菌四小时仅可繁殖6 倍。 2. 生命力强:无湿状态可耐低温-60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧 (嗜氧繁殖)、耐低氧(厌氧繁殖)。 3.体积大:体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。 四、实验材料和用具四、实验材料和用具 4.14.1 土样采集土样采集：采集广大植物园内的有机土壤，和生化楼下花坛的有机土壤 4.24.2 营养琼脂营养琼脂(%(%)：蛋白胨 1牛肉膏 0.3氯化钠 0.5琼脂 1.5 ～2.0蒸馏水 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内， 加入 15%氢氧化钠溶液约 2mL，校正 pH 至 7.2～ 7.4。加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。 4.34.3 淀粉牛肉膏蛋白胨培养基淀粉牛肉膏蛋白胨培养基(%)(%)：可溶性淀粉 0.2牛肉 0.3蛋白 1.0氯化钠 0.5琼脂 1.5～2.0校正 pH 至 7.2～7.4 4.44.4 发酵培养基发酵培养基(%)(%)：玉米粉 2黄豆饼粉 1.5CaCl 0.02MgSO4 0.02NaCl 0.25 K2HPO4 0.2柠檬酸钠 0.2硫酸氨 0.075(溶解后加)Na2HPO40.2校正 pH 值 7.0 4.54.5 葡萄糖蛋白胨培养基葡萄糖蛋白胨培养基 （（V.PV.P 试验用）试验用） （（%%）） ： 葡萄糖 0.5蛋白胨 0.5K2HPO4 0.2 校正 pH 7.2～7.4 4.64.6 蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基 （吲哚试验用）（吲哚试验用） （（%%） ： 蛋白胨 1%氯化钠 0.5%校正 pH 7.2～ 7.4 4.74.7 西蒙氏柠檬酸盐培养基（西蒙氏柠檬酸盐培养基（%%））：氯化钠 0.5硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02磷酸 二氢铵 0.1磷酸氢二钾 0.1柠檬酸 0.5琼脂 2溴麝香草酚蓝溶液 4酚红试剂 校正 pH6.8 先将盐类溶解于水中，校正pH，再加入琼脂，加热融化，然后加入指示剂，混匀后分 装试管，121℃高温灭菌 15min。 4.84.8 配制营养明胶培养基（配制营养明胶培养基（%%））：蛋白胨 0.5、牛肉膏 0.3、明胶 1.2，调 pH 6.8~7.0 4.94.9 耐盐培养基（耐盐培养基（%%））： ①蛋白胨 1牛肉膏 0.3氯化钠 2琼脂 1.5 ～2.0蒸馏水 ②蛋白胨 1牛肉膏 0.3氯化钠 10琼脂 1.5 ～2.0蒸馏水 ③蛋白胨 1牛肉膏 0.3氯化钠 20琼脂 1.5 ～2.0蒸馏水 ④蛋白胨 1牛肉膏 0.3氯化钠 25琼脂 1.5 ～2.0蒸馏水 加入 15%氢氧化钠溶液约2mL，校正 pH 至 7.2～7.4。加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。 4.104.10 溶液或试剂溶液或试剂染料 染料 革兰氏染色革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇; 芽孢染色芽孢染色：5%孔雀绿溶液, 石炭酸复红液; 香柏油、二甲苯 吲哚试验吲哚试验：乙醚、吲哚试剂 V.P.V.P.试验试验：40％NaOH 溶液、α-奈酚， 淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定：1%3, 5- 二硝基水杨酸试剂 4.114.11 仪器或其它用具仪器或其它用具 无菌玻璃涂棒无菌吸管接种环无菌培养皿土样三角瓶烧杯洗瓶 玻棒试管酒精灯 擦镜纸接种环酒精灯载玻片吸水纸等。 2 恒温摇床 恒温培养箱 高压蒸汽灭菌箱 超净工作台 水浴箱 紫外灯照射箱 磁力搅拌器 玻 璃珠 移液管 涂布器显微镜 五、实验方法及步骤五、实验方法及步骤 1 1、初筛方法、初筛方法 ①制菌悬液制菌悬液：两个土样分别取5g，放入各自装有45mL 无菌水的三角瓶，振荡10min,即为 稀释 10-1的土壤悬浮液。每个环境的土样装 1 个锥形瓶，共 2 个，同时将其分为 4 组，编 号 AB。 ②加热筛选有芽孢的