肥达试验和沉淀反应试验报告

实验报告实验报告 实验名称实验名称 院院系系 姓姓名名 肥达试验肥达试验 专专业业 学学号号 实验日期实验日期 班班级级 一、实验目的一、实验目的 学会肥达反应的原理、 方法以及结果分析。 理解肥达反应在伤寒和副伤寒杆菌感染检测中的 应用。 二、实验器材二、实验器材 试剂试剂： 生理盐水、患者血清、伤寒杆菌H 菌液、伤寒杆菌O 菌液、甲型副伤寒杆菌H 液、乙型副 伤寒杆菌 H 菌液 器材器材： 水浴锅、冰箱、小试管 32 支、试管架、记号笔、移液枪 三、实验原理三、实验原理 1.伤寒杆菌有三种抗原：分别为菌体抗原（O 抗原） 、鞭毛抗原（H 抗原） 、体表抗原（Vi 抗原） 。其中以 O 抗原及 H 抗原的抗原性较强，而 Vi 抗原的抗原性不强，且相应抗体效价 低且为时短暂，随细菌的消除而消失，故不列为肥达试验的检测项目。 （但其检查有助于发 现伤寒带菌者。 ）当抗原遇到特异性抗体（抗O 及抗 H）时，便会发生凝集反应，通过对凝 集物量多少来推算病人体内抗体的多少，以协助诊断、治疗及判断预后。 2.用已知的伤寒沙门菌菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原，以及引起副伤寒的甲型副伤寒沙 门菌、乙型副伤寒沙门菌 H 抗原的诊断菌液与受检血清做试管或微孔板凝集实验，测定受 检血清中有无相应抗体及其效价的试验。 四、实验过程及步骤四、实验过程及步骤 1. 取清洁小试管 32 支，分成 4 排，每排 8 支，依次编号。 2.32 支小试管，用移液枪各注入0.5ml 生理盐水。 3.第一管内加入 1：10 稀释的患者血清 0.5ml，用 1ml 吸管吹吸三次，混匀，吸出0.5ml 注入 第二管作对倍稀释，……依次稀释至第7 管，弃去0.5ml，第8 管为对照。第二排、第三排、 第四排以相同步骤加入患者血清。 4. 第一排各管内注入伤寒杆菌H 菌液 0.5ml；第二排各管注入伤寒杆菌O 菌液 0.5ml；第三 排各加入甲型副作寒杆菌H 液 0.5ml；第四排各管加入乙型副伤寒杆菌H 菌液 0.5ml。 -精品- 5. 置于 56℃水浴箱 2~4 小时。 6.放冰箱过夜或放 37℃水浴箱 18 小时后观察结果。 7. 结果观察 最强:上液澄清，细菌全部凝集沉淀于管底。 强：上液轻度混浊，细菌大部分凝集沉淀于管底。 弱：上液混浊，细菌少部分凝集。 不凝：液体呈乳状与对照管相同。 五、实验总结五、实验总结 1.结果与分析： 先观察对照管，正确结果应无凝集现象，再观察各试验管的凝集现象，凝集程度以“ +”多 少表示之。 （+++）最强，上液澄清，细菌全部凝集沉淀于管底。 （++）强，上液轻度混浊，细菌大部分凝集沉淀于管底。 （+）弱，上液混浊，细菌少部分凝集。 （-）不凝，液体呈乳状与对照管相同。 效价判定：以能出现“++”凝集现象的血清最高稀释度为该血清的凝集效价。 一般认为 O 抗体效价在 1：80 以上，H 抗体效价在 1：160 以上，有辅助诊断意义。 H 甲或 H乙达到 1：80 或以上具有诊断意义。 但在分析结果时，应注意以下两点： （1）非肠热症患者，由于曾接种过伤寒，副伤寒疫苗或以往在流行区有过隐性感染或患过 伤寒，副伤寒，以及回忆反应等原因，也可呈现阳性结果。不过，由这些原因所引起的阳性 反应主要是 H 抗体升高，O 抗体效价一般不高，同时，每隔 5~7 天试血一次，其抗体效价 一般不会随病程而升高。上述这些都有别于现症感染。 （2）少数肠热症患者，由于发病初期曾使用大量抗生素，或机体有免疫缺陷病，或机体反 应性极弱等原因，抗体效价可以很低，甚至为阴性结果。 因此不能只根据肥达氏试验的结果去作简单肯定或否定的结论， 必须结合当地流行情况， 既 往接触史，以及临床症状和体征，做出正确的判断。 2.肥达反应的诊断标准： 肥达反应是诊断伤寒副伤寒的辅助诊断， 其结果的解释必须结合临床变现和病程， 病史，以 及地区流行病学情况。 机体患伤寒、副伤寒，一般于发病后 1~2 周内血液中出现特异性抗体并且随着病程延长而 效价渐升，此时即可为阳性，第4 周可达峰值，以后又逐渐降低。 一般以“O”凝集效价在 1/80 或以上和“H”在 1/160 或以上为阳性。 O 抗体主要是 IgM,出现较早；H 抗体主要是 IgG,出现较晚。根据此特点，肥达试验结果有 如下诊断价值： 二者均超过正常值，患伤寒的可能性大； -精品- 二者均在正常值内，患伤寒的可能性小； H 抗体效价超过正常值，O 抗体效价正常，可能是接种了伤寒菌苗或者是接种的回忆反应； O 抗体效价超过正常值，H 抗体效价正常，可能是伤寒早期或者其他沙门氏菌感染； 一般间隔 1~2 周复查，若抗体效价比前次结果增高2~4 倍，则具有诊断价值。 六、教师评价六、教师评价 实验报告实验报告 实验名称实验名称 院院系系 姓姓名名 沉淀反应沉淀反应 专专业业 学学号号 实验日期实验日期 班班级级 一、实验目的一、实验目的 掌握对流免疫电泳的原理和方法，了解其用途。 二、实验器材二、实验器材 器材器材： 电子天平、锥形瓶、200ml 量筒、药匙、称量纸、水浴锅、微波炉、洗耳球、玻片、移液管、 -精品- 废液缸、打孔器、胶头滴管、移液枪、镊子、纱布条、电泳槽 试剂试剂： pH8.6 0.05mol/L 巴比妥缓冲液、琼脂粉 三、实验原理三、实验原理 1.对流免疫电泳也称反向免疫电泳或免疫电渗电泳， 其实质是定向加速的电泳技术与免疫双 扩散技术的结合。 抗原和抗体在一定的 pH 条件下， 由于带电荷量的多少及分子量大小不同， 在电场中以不同的速度作定向移动。在pH8.6 的缓冲液中，多数蛋白质抗原物质带负电荷， 在电场作用下向阳极移动；而其抗体大多为γ球蛋白，等电点较高，带负电荷较少，且分子 量较大，电泳速度慢，受电渗作用影响向负极移动。由于抗原抗体孔相对排列，当两者比例 适当时，特异性抗原抗体互相结合形成肉眼可见的白色沉淀线。 同时，由于电场限制了抗原 抗体分子的自由扩散，从而提高了试验的敏感性， 且缩短了试验时间。此法可用于抗原或抗 体的快速诊断。但缺点是分辨力低，较复杂的抗原抗体系统不宜用此法。 2.在一定温度和电解质存在的条件下， 可溶性抗原与相应抗体在比例合适处形成肉眼可见的 沉淀线，称为沉淀反应(precipitationreaction)。参与反应的抗原称为沉淀原， 抗体称为沉淀素。 可溶性沉淀原分子小，单位体积内所含的抗原量多， 与抗体结合的总面积大， 故试验时需对 抗原进行稀释， 确保抗原与抗体以合适的比例结合， 并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。 目前广泛应用的沉淀反应是凝胶免疫扩散(Agar—gelimunodiffusion)。在凝胶内电解质的参与 下，特异性抗原、抗体在凝胶内扩散并相遇，免疫复合物在最适比例处（在平衡区带，即抗 体决定簇的数目等于抗原决定簇数目时） 发生沉淀。常用的 1~2％琼脂凝胶形成的构架网孔 较大，允许分子量在 20 万以下的物质（如绝大多数可溶性抗原和抗体）通过，在凝胶中自 由扩散。而免疫复合物因颗粒较大不扩散， 形成沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异 性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时， 便依各自扩散速度的差