液相常见问题

液相的常见问题： 一、在实际工作中，我们经常能遇到基线的漂移的情况。关于基线漂移（或上下 波动）的原因，可能有以下几种： 1、柱子的平衡时间长。一般来说，新柱子的平衡时间要短。有些老柱子的平衡 是时间长。当然，柱子的平衡是时间也和它使用的流动相有关系。如果使用了离 子对试剂，那么比普通的简单的流动相（例如 二元流动相：甲醇：水，乙腈： 水， ， ， ， ， ， ） 2、系统存在漏点。如果系统存在漏点，那么出现基线向下漂移。需要检漏 3、PUMP 头有气泡。PUMP 头的气泡会导致基线的漂移和波动。如果怀疑是 PUPM 头有气泡导致基线不稳，只需要看仪器的压力是否稳定就好。 4、流动相脱气。如果流动相没有脱气，基线肯定是不稳的 5、柱后气泡。在柱子后有气泡产生，导致检测器中的读数有波动。 6、PUMP 密封不好。密封不好，也会导致PUMP 头的气泡（好象不可能）和漏夜， 基线当然不稳定了。 7、系统的环境。仪器的使用，如温度的变化，流速的变化， ， ， ， ， ， ，以及梯度洗 脱，当然基线漂移 8、单向阀睹塞或污染。单向阀的睹塞和污染，能造成流量不准确，压力 波动。 故也会波动，漂移 9、检测器污染或有杂质 10、如果是紫外或二极管阵列检测器（PDA） ，排除以上原因还出现基线噪音大， 就有可能是氘灯的能量不足了 二、主峰后面有很多杂质峰可能原因 1，仪器问题：最有可能的就是系统污染，尤其是管路，比如，入口单向阀或各 接口处等有盐残留； 2，色谱柱问题：这个好办，换新的色谱柱，大部分能解决问题； 3，试剂试药问题：所用试剂、试药达不到色谱级别所需，或者不同批号不同厂 家的东西都有可能影响，最直接影响的就是物质的纯度影响流动相的吸收； 4，梯度洗脱程序：梯度洗脱程序设置不合理，比如在某个时间段急剧变化； 5，其他：如配制方法不同，超声方法不同等。 如今，看似很简单的问题，在经过很长一段时间的摸索后发现，上述原因其实都 是比较客观的，如果以上 4 点都解决不了，可以考虑以下原因：仪器本身功能上 的区别导致。比如安捷伦低压梯度和高压梯度做的同样的东西，能重复出来，而 且梯度峰都很小，甚至没有，而用岛津的低压和高压梯度仪器，所表现的就不一 样了，具体原因，因只具有经验所得，所以目前只能作为讨论的一个话题，仅供 各位参考。 三、冲洗液相管路 1、如果系统污染可以考虑用异丙醇冲洗，把过滤后的异丙醇当流动相，以 min 冲洗 30-60 分钟，一般杂质就可清除。如果不行可以考虑 12%的磷酸冲洗， 它可以有效清洗不锈钢和其它材料的管路， 清除有机杂质及污垢，比用有机溶剂 更有效，也比用稀硝酸有效（用5-15%硝酸清洗虽然有效，但是清洗后系统很难 平衡，特别低紫外区域） 。磷酸清洗方法如下：先用甲醇或者乙腈彻底清洗系统， 然后是纯水，然后是 12%磷酸冲洗 60 分钟左右，冲洗过程中可以将进样器一并 冲洗，然后换用水，甲醇或乙腈冲洗，这样就基本可以了。 2、用 5%硝酸洗脱管路 1h 后未知峰去无踪，效果不错，推荐大家有必要试 试如果不是污染严重，还是别用硝酸洗脱管路，因硝酸对不锈钢管路损害较大 四、梯度洗脱 做梯度洗脱有时候是会这个样子的， 基线会漂移的满厉害的。要用足够的时 间来平衡， 如果有在线脱气装置会好一点。特别是走梯度洗脱时后面往往有一些 杂峰而有机相在不同的比例下吸光度也不一样，由于 UV 检测的是相对吸收度， 所以就造成了基线漂移。而且，如果柱子没有平衡好，这种漂移也不一样。如果 走上两个小时后，这种漂移相对就稳定。在梯度分析时，流动相的选择和波长的 选择是很重要的； 在梯度洗脱时， 一般波长不应再变， 否则再高的水平也做不好， 尤其在低波长时。 分析波长较高时，流动相相对容易些，如在300nm 以上，影响相对较小。但 是，在大多数的情况下，流动相首选低紫外吸收的，如乙腈和水，少用甲醇和四 氢呋喃，无机盐以磷酸盐等低紫外吸收的为好，少用醋酸盐、柠檬酸等有机盐， 酸用磷酸和硫酸少用醋酸， 同时梯度变化尽可能小和缓和， 虽然分析时间将增加。 另外，A，B（C）相都采用混合流动相，以减少流动相变化对紫外的影响。还有 一点， 所用的试剂要求为色谱纯， 国内有的厂家所标的色谱纯连化学纯的都不如， 有一些特定的添加试剂，如离子对试剂，只能使用进口的色谱纯级。注意以上几 点，你的梯度色谱图必将大有改观。当然你的仪器也要好的了。 建议您使用一种方法：扣除本底法。此种方法由色谱工作站来完成，具体方 法是：1、不进样，严格按梯度方法空跑出基线，得出不进样的梯度基线。 2、进 样，做梯度洗脱，得到谱图。3、在工作站上用谱图相减的功能处理，用谱图减 去梯度基线，即可得到比较漂亮的谱图，而且不影响定量计算！ 五、样品池污染 1、如果是流通池脏，可以把柱子去下来，用50－50（v/V)的异丙醇、异丙醇纯 水、来冲洗流通池。如果还不行，用 1N 的硝酸冲流通池，再用纯水冲洗。 样品池污染#6935925 2、液相管路脏、样品池脏、样品池能量比参比池低很多，处理方法：不接柱子， 接上二通管，用 8%硝酸冲洗 2 小时，纯水冲洗 2 小时，用甲醇过度，接着用异 丙醇冲洗 2 小时，最后过度成甲醇。结果：基线平稳，峰行明显改善，样品池能 量恢复 六、异丙醇的作用： 在安捷伦液相中会使用的 10％异丙醇，它的作用是柱塞清洗附件的清洗液， 它主要是当流动相中含有盐类时，为了防止盐类在柱塞产生结晶，磨损宝石杆和 柱塞密封圈，加入异丙醇 10％异丙醇一方面有防止长菌的作用，另一方面有增 加清洗液的润湿性，减少泵内气泡产生。在泵运行的时候一定不能干。异丙醇是 一个很特殊的角色，是维护液相的专业溶剂，它的“露面”至少有以下几处： 1、10%的异丙醇是柱塞清洗附件的清洗液。 2、更换密封圈后用异丙醇磨合。 3、洗针用溶剂。 4、峰拖尾时，可尝试用异丙醇冲柱子。 5、泵的压缩性补偿值，是以异丙醇为基准：标准的 100，而常用的流动相：甲 醇 120，乙腈 115，而水则偏差较大，是 46。 6、正相和反相系统转换时的中间过度溶剂。 另外在其他厂家的液相中使用 30％甲醇，作用都是和异丙醇的一样，用于洗泵 和洗针。 七、检测限与定量限 S/N=3 时的浓度是检测限，也就是峰高约在基线噪音高的3 倍，注入液相色 谱仪的对照品百分浓度％。S/N=10 是定量限，也就是峰高约在基线噪音高的 10 倍时，注入液相色谱仪的对照品量。首先，配制一个较低浓度的对照品溶液，注 入液相色谱仪，观察其峰高比基线噪音高多少倍（假设 X 倍） ，将该溶液稀释到 X/3 倍，基本即为该物质的检测限，将该溶液稀释到 X/10 倍，基本即为该物质 的定量限。 在新的“指导原则”中提到了检测限和定量限，以检测限为例：“检测限系 指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。”“无论用 何种方法，均应用一定数量的样品，其浓度为近于或等于检测限，进行分析，以 可靠地测定检测限。”其中第一句中指出是最低量，但第二句中又类比为浓度， 所以，可以看出，官方对这个概念的定义也不是很严格。另外，在报新药时，可 同时写入申报资料，如标题是：检测限的测定；结果中写：最低检测量