基因工程药学整理重点复习提纲

第一章 基因工程： 在分子水平上对基因进行操作的复杂技术， 将外源基因通过在体外重组导入受体 细胞内，使这个基因在受体细胞内复制、转录、翻译表达的过程。 基因工程药学：应用基因工程技术，研制和开发核酸、 多肽和蛋白质药物的理论、方法和应 用的一门学问。 基因工程药物的特征： 第一， 基因工程药物来源的过程应当是外源核酸分子在不同种寄主细 胞中进行繁殖， 能够跨越天然物种屏障， 把来自任何一种生物的基因放置在新的生物细胞中， 而这种生物与原生物毫无亲缘关系。第二，所表达基因工程药物的DNA 小片段在新的寄主 细胞中进行扩增，实现很少量的DNA 样品拷贝出大量的 DNA 分子，而且是大量的没有任何 其他 DNA 序列污染的，绝对纯净的DNA 分子群体，再由这些 DNA 分子群体经转录、翻译、 翻译后蛋白质折叠、修饰最后成为具有生物活性的基因工程药物。 基因工程药学的主要研究内容： 一，用基因工程技术制备体内缺乏的多肽或蛋白质， 来替代 或补充体内对这类活性多肽或蛋白质的需求。二， 研究蛋白质的生物学活性。三， 研究基因 工程药物的临床应用。 基因工程技术方法：1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、目的基因导入受体细胞 4、 阳性克隆的筛选鉴定5、 表达蛋白的生产和纯化6、 理化、 生物活性和毒性的一系列检测。 第二章 基因克隆主要包括：1、连接外源基因和克隆载体，构建重组DNA 分子 2、将重组DNA 分子 导入受体细胞，使外源基因随受体细胞的分裂而复制、扩增。 限制 restriction：限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA 切成小片段。 修饰 modification：细菌自身的DNA 碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制 性内切酶所识别切割。 平末端 blunt or end：有些限制性核酸内切酶能够在识别序列中间的同一个位置进行将 DNA 双链切断，产生的DNA 末端为平末端。产生的平末端DNA 可以任意连接，但连接效率 低。 黏性末端 sticky end：大多数的限制性核酸内切酶在两条链错开2~4 个核苷酸处切断，这样 产生的 DNA 末端带有 5‘突出或者 3’突出的 DNA 单链，这样的末端称为黏性末端。连接效率 高，从 3‘末端切割的产生的是3‘黏性末端，5’末端切割的产生的是 5‘黏性末端。 位点偏爱 site preference： 有些限制性内切酶对同一底物的不同位点表现出偏爱切割的特性， 即对不同位置的同一识别序列表现出不同的切割效率。这种现象就叫做位点偏爱。 熟悉：酶切反应条件 1、缓冲液：缓冲剂，Mg2+，DTT(二硫苏糖醇)，BSA（小牛血清白蛋白） 分为三组低盐组（0~50mmol/L） 、中盐组（50~100mmol/L） 、高盐组（100~150mmol/L） 2、限制性内切酶的反应温度一般为37℃（Taq为 65℃，Apo I 为 50℃） 3、反应时间：通常为一个小时或者更多，酶延长反应时间，可减少酶的用量 4、终止酶切反应的方法： EDTA螯合镁离子 （10mmol/L） 、 加热 （65℃或80℃处理20min） 、 苯酚抽提去除蛋白和试剂盒纯化DNA（用于耐高温的） 星号活性star activity：指在非最适的反应条件下，有些酶的识别特异性会降低，表现出松弛 的专一性 避免的星号活性方式： 1、 较少的甘油浓度 2、 保证反应体系内无有机溶剂3、 减少酶的用量， 防止过度酶切 4、控制酶切反应的 pH 5、适当提高缓冲液离子强度。 甲基化酶用于保护宿主的DNA 不被相应的限制酶所切割。 DNADNA 聚合酶的共同特点聚合酶的共同特点： 都能够把脱氧核糖核苷酸连续地加入双链DNA 分子引物链的3’-OH 末端；催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板链上解离的情况。 DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 有三种不同的酶催活性有三种不同的酶催活性： ① 5‘→3’的聚合酶活性。 ② 5‘→3’的核酸外切酶活 性。 ③ 3‘→5’的核酸外切酶活性。 熟悉：DNA 聚合酶 I 可以被分割成两个片段①具有完全的 5‘→3’的核酸外切酶活性。②具 有完全的 5‘→3’的聚合酶活性和 3‘→5’的核酸外切酶活性。 Klenow DNAKlenow DNA 聚合酶聚合酶：具有 DNA 聚合酶 I 的 5‘→3’的聚合酶活性和 3‘→5’的核酸外切酶活性。 用途：1、修补经限制性核酸内切酶产生的3‘隐蔽末端。2、标记DNA 片段的末端。3、合成 cDNA 克隆中 cDNA 的第二条链。4、DNA 序列测定。5、DNA 定点突变。 T7DNAT7DNA 聚合酶的优点聚合酶的优点： 1、持续合成能力强，一旦与模板链结合就会不间断的合成互补链 2、3’→5‘外切酶活性强，单链和双链都能水解 3、不受 DNA 二级结构的影响，其他合成酶受DNA 二级结构的影响。 第三章 基因组文库和 cDNA 文库的异同 两者获取核酸的来源不同， 基因组文库来源于染色体DNA， cDNA文库是从细胞中分离总RNA 和 mRNA，然后以 mRNA 为模板反转录合成 cDNA，与载体相连，转化宿主细胞而成。两者 建库的技术路线不同， 产生的基因结构不同， 应用也不同。如果研究的目标是要弄清楚一种 蛋白质的氨基酸序列，则可以根据克隆的 cDNA 分子的核苷酸序列直接推导。如果要研究的 是控制基因表达活动的调控序列，或者是在mRNA 分子中不存在的某些特定序列，有关这 类的信息就只能从染色体基因组DNA 中获得。 在 mRNA 群体中有些 mRNA 的拷贝数很多，它们的量几乎占总mRNA 的 50%~90%，但种类 却很少，被称为高丰度 mRNA。另外的一些 mRNA 拷贝数很少，低于总 mRNA 的 0.5%，但 种类却很多，称为低丰度mRNA。 第四章 聚合酶链式反应 PCR：是一种选择性体外扩增DNA 或 RNA 片段的技术，又称为无细胞分子 克隆或特异性 DNA 序列体外引物定向酶促扩增法。 它与分子克隆和 DNA 测序并称为分子生 物学的三大主流技术，构成了分子生物学的主要实验基础。 PCR 的基本原理：与细胞内DNA 复制相似，以拟扩增的DNA 分子为模板，一对与模板链分 别互补的寡聚核苷酸片段为引物，在耐热DNA 聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制， 沿着模板链上延伸合成新的DNA。 PCR 的步骤： 一、变性 通过升温使目标 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成作为反应模板链的单链DNA。变性的温 度由 G+C 的含量决定，含量越高，解离温度越高。 变性的时间由模板 DNA 的长度决定， 长度越长，解离时间越长。 二、退火 将反应体系冷却至特定温度， 使引物与模板 DNA 的互补区结合， 形成模板-引物复合物。 退火温度过高，则使引物和模板DNA 不能很好地结合，扩增效率下降。退火温度过低， 则使引物非特异性的和模板DNA 结合，形成非特异性DNA 片段。退火温度通过预实验 来确定，一般比引物与模板的熔解温度Tm低 3~5° 三、延伸 将反应体系的温度提高至热稳定DNA 聚合酶的最适工作温度，并维持一段时间。 一般的 Taq酶最适工作温度为