沙门氏菌的检验

沙沙门门氏氏菌菌的的检检验验 食品学院14 食品质量与安全 1 班 刘文敏柳基炜卫杰恒温紫君 摘要：摘要：本实验采用 GB/的检测方法测定鸡场中的沙门氏菌。通过本实验学习沙门氏菌 的检测方法和技术， 了解沙门氏菌的一些生化特性； 本实验先用显色培养基找出可疑菌 落， 再做生化试验找出可疑的典型性的沙门氏菌， 再通过血清学试验最终确定是否为沙 门氏菌属。 关键词：关键词：沙门氏菌 接种 生化试验 血清学鉴定 前前言言 沙门氏菌病是公共卫生学中具有重要意义的人畜共患病种之一， 其病原沙门氏菌属 于肠道细菌科。沙门氏菌是一个统称，泛指 2000 多种有紧密连系的细菌，包括引起食 物中毒， 导致胃肠炎、 伤寒和副伤寒的细菌。 虽然只有少数人因沙门氏菌而患病， 但是， 在世界范围内的细菌性食物中毒事件中， 由沙门氏菌引起的占大多数。 因此， 采用科学、 合理的方法检验食品中沙门氏菌，已经成为了人们最关心的问题之一[1]。国标法是目前 中国规定的食品中沙门氏菌的标准检测方法 ,也是基层实验室普遍采用的检测方法 ,它 根据沙门氏菌的生长特点和生化特性,采取前增菌、增菌、分离、生化试验和血清学鉴 定 5 个步骤进行[2]。 1 材料与方法 实验材料 均质器、三角烧瓶、平皿、玻璃棒、接种棒 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃ 吸管：1 mL（具 mL 刻度） 、10mL（具刻度或微量移液器及吸头 电子天平 PL602-S，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司； 手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅 SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂 试剂药品 鸡肠、靛基质试剂、沙门氏菌O 和 H 诊断血清、API20E 生化试剂盒或 VITEKGNI 生化鉴 定卡 培养基 蛋白胨水 （BPW)、 四硫磺酸钠煌绿 （TTB） 、 亚硒酸盐胱氨酸 （SC） 增菌液、 亚硫酸铋 （BS） 琼脂、HE 琼脂、三糖铁琼脂、蛋白胨水、尿素琼脂、氰化钾、氰化钾对照、赖氨酸脱 羧酶、赖氨酸脱羧酶对照、甘露醇、山梨醇、β-D 半乳糖苷（ONPG）培养基 实验方法 培养基的制备 培养基的配制步骤培养基的配制步骤 蛋白胨水（BPW） ：称取蛋白胨 10g、氯化钠 5g、磷酸氢二钠 9g、磷酸二氢钠、蒸馏水 1000ml，将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH，高 压灭菌 121 ℃，15 min。 分装 10 瓶，每瓶 90ml 四硫磺酸钠煌绿（TTB） ：高压灭菌 121 ℃，15 min 灭菌冷却后至 30℃，每 100ml 基础 培养液加碘液 2ml，煌绿液 1ml 配制培养基的注意事项配制培养基的注意事项 （1)按照说明书上的用量进行换算，称取准确分量的合成培养基粉末； （2）加热煮沸溶解培养基时，留意锅内水位的变化，水位下降可再添加适量的水，以 免水分蒸发过多，导致后面分装不够量； （3）往试管中放小导管时，注意处理气泡。 沙门氏菌群检测 2 沙门氏菌检测操作步骤 前增菌 称取 10 g（mL）样品放入盛有 90 mL BPW的无菌均质杯中，以 8 000 r/min～10 000 r/min 均质 1 min～2 min，或置于盛有 90 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均 质器拍打 1 min～2 min。使用均质袋，可直接进行培养，于 36 ℃±1 ℃培养 8 h～ 18h。 増菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于 10mL TTB 内，于 42℃±1℃培 养 18h～24h。同时，另取 1mL，转种于 10mL SC 内，于 36℃±1℃培养 18 h～24h。 分离 分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 HE 琼脂平板 。 于 36℃±1℃分别培养 18 h～24 h（HE 琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或 40h～48h（BS 琼脂平板） ，观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表 1 生化试验 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落， 接种三糖铁琼脂， 先在斜 面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼 脂平板，于36℃±1℃培养 18h～24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱 羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表 2。 在三糖铁琼脂内斜面产酸， 底层产酸， 同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除。 其他的反应结果均有沙门氏菌属的可能，同时也均有不是沙门氏菌属的可能。 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛 基质试验） 、尿素琼脂（） 、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂 平板上挑取可疑菌落接种。于 36℃±1℃培养 18 h～24 h，必要时可延长至 48h，按表 3 判定结果。 将已挑菌落的平板储存于 2℃～5℃或室温至少保留 24h， 以备必要时复查。 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1 项异常，按表 4 可判定为沙门氏菌，如有 2 项异常为非沙门氏菌。 反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为 阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。 反应序号 A3：补做 ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤 寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 必要时按表 5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。 血清学鉴定 滴一定生理盐水在载玻片靠近磨砂的一边作对照，在另外一边滴一滴血清，用灭菌后 的接种环从三糖铁琼脂培养基的斜面取一点菌种， 放进血清中， 然后用酒精灯将接种环 灭菌冷却后，再取少量菌种放进生理盐水中。观察血清中的的菌落是否凝结，与生理盐 水中的菌落对比。 结果与报告 综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告 25 g（mL）样品中检出或未检出沙门 氏菌。 3 实验结果与分析 沙门氏菌检测现象和结果（见表 7） 表 7沙门氏菌检测现象和结果 试剂硫化氢蛋白胨（加尿素 靛基质） 现象 结果 黑色 + 不变色 - 桃红色 + 不浑浊 - 氰化钾赖氨酸脱羧 酶 绿色 + 注：+阳性，-阴性 实验结果分析 对照沙门氏菌生化反应初步鉴定表，尿素，氰化钾，赖氨酸脱羧酸三项中有两项异 常，按沙门氏菌生化鉴定表可判定结果为非沙门氏菌属。 甘露醇和山梨醇试验现象和结果 甘露醇和山梨醇都变成黄色，表现为阳性。需要补做血清学鉴定试验。 OPNG 试验现象和结果 OPNG 变成深黄色，表现为阳性，为非沙门氏菌属。 血清学鉴定实验现象和结果 血清中的菌落没有出现凝结现象，与生理盐水中的菌落现象一样。 实验结果分析 血清学鉴定结果为该菌落为非沙门氏菌属。 4 实验结论与讨论 结论：综合以上生化试验和血清学试验的结果，25g 样品中未检出沙门氏菌属。? 讨论：沙门氏菌是重要的肠道致病菌，肠炎沙门氏菌是其中的一种，常引起鸡、 鸭等禽类感染，还可引起食物中毒［5］，但是实验结果显示为非沙门氏菌属，可见实验结 果的正确性可信性不高，实验过程中可能存在操作失误（如接种环还未冷却就取种，导 致菌种死亡）或者其他原因导致实验偏差，应该