肝动脉灌注化疗抑制肝癌血管生成探究
肝动脉灌注化疗抑制肝癌血管生成探究 【摘要】目的:通过对肝癌大鼠进行肝动脉区域灌 注化疗,研究其对肿瘤血管生成的影响。方法:建立大鼠肝 癌模型后,将造模2周后的肝内荷瘤大鼠18只,按照随机 数字表法分为对照组、外周静脉组和肝动脉组各6只。大鼠 的5-FU给药剂量为20 mg/kg,连续给药4 do化疗结束后 第7天摘取肝脏肿瘤,采用免疫组化法检测VEGF和CD34在 肝癌组织中的表达。通过VEGF蛋白染色测定积分光密度 (I0D), CD34标记血管内皮细胞检测肿瘤内微血管密度 (MVD ) o结果:对照组VEGF表达(I0D值)为 (46351.48 + 2926. 24 ),明显高于外周静脉组 (43678. 84 + 2852. 76)和肝动脉组(35518. 86±2657. 16), 且肝动脉组的肝癌VEGF表达明显低于外周静脉组,差异均 有统计学意义(P0. 05)。结论:肝动脉灌注化疗能有效抑制 肝癌组织VEGF表达,降低MVD,从而抑制肿瘤血管生成。 【关键词】肝癌;肝动脉灌注化疗;血管生成;血 管内皮生长因子;微血管密度 肝动脉灌注化疗是肝癌常用的区域灌注化疗方法,目前 常作为肝癌术后治疗和不能切除的晚期肝癌治疗的重要手 段。既往的研究提示经肝动脉区域灌注化疗可显著提高肝脏 组织药物浓度,同时达到减少药物在外周血和全身其他部位 分布[1]。化疗药物抑制肿瘤血管生成是抗肿瘤的重要机制, 本文以5-Fu为化疗代表药物,通过对肝癌大鼠进行肝动脉 区域灌注化疗,研究其对肿瘤血管生成的影响,现报告如下。 1材料与方法 1. 1试剂与药品兔抗鼠CD34多克隆抗体,VEGF多克隆 抗体,武汉博士德有限公司生产。DAB显色试剂盒,SP即用 型试剂盒,PBS缓冲液,福州迈新有限公司生产。5-FU由南 通精华制药公司提供,批号:070402,规格10 mL: 0.25 g。 1.2肿瘤细胞株和实验动物CBRH-7919大鼠肝癌细胞 株,中山大学细胞保藏中心提供。(l)BALB/c雄性裸鼠2只, 17. 1〜19. 6 g重,作种鼠皮下接种肿瘤细胞。(2) Wistar 雄性大鼠18只,(120+15) g重,作肝内种植肿瘤用。上述 动物均为SPF(无特定病原)级,由中山大学动物中心提供。 1. 3方法 1.3.1大鼠肝癌模型的建立 将培养好的大鼠肝癌细胞 注射于裸小鼠背部皮下,2周后成瘤并取出,切成1 mmXl mmXl mm瘤块。然后采用肝内隧道植入法将瘤块接种于 Wistar大鼠肝左叶。手术当天始腹腔注射氢化可的松2 mg/ 只/dX5 do术后密切观察造模后荷瘤大鼠的生物学行为、 死亡情况等。 1.3.2实验分组及给药造模2周后,将18只荷瘤大鼠 按照随机数字表法分为对照组(不作任何处理)、外周静脉 组(经尾静脉注射)、肝动脉组(经胃十二指肠动脉插管至 肝动脉给药),6只/组。大鼠的5-FU给药剂量为20 mg/kg, 连续给药4 do 1. 3. 3标本采集和处理化疗结束后第7天处死大鼠摘 除肝脏肿瘤组织,并置于10%福尔马林中固定后石蜡包埋。 将瘤体石蜡标本块切片,厚度约5 umo脱蜡后通过微波加 热法修复抗原,予免疫组织化学染色。每例标本取2张切片, 滴加CD34抗体和VEGF多抗各1滴。 1. 3. 4 VEGF检测 标本经染色封片后在显微镜下(X200) 观察,细胞浆显示棕黄色颗粒为VEGF阳性细胞。每张切片 选阳性表达最高的5个高倍视野(X400)照相,采用IPP图 像分析软件将VEGF蛋白染色的黄色区域作为AOI (area of interest)测定分析光密度。取5个视野的积分光密度(I0D) 平均值作为该标本的表达强度计量值。 1. 3. 5 MVD检测 参照Weidner的标准计算各组肿瘤内的 微血管密度(MVD):低倍镜下(X100)寻找切片中棕黄染 色密度最高的区域,即为富含血管组织的“热点”区。再在 高倍镜下(X400)按染色为棕黄色的内皮细胞均记为一条 独立血管的标准计算血管数目。每张切片分别选10个不同 高倍视野计算MVD,取平均值。 1.4统计学处理采用SPSS 13.0软件对所得数据进行 统计分析,计量资料用(x土s)表示,比较采用t检验,以 PO. O5)o 3讨论 区域灌注化疗可以增加癌灶和靶组织器官的化疗药物 浓度和/或降低外周血及其他组织的药物分布,是目前实体 肿瘤化疗增效减毒的重要措施和手段之一 [1-2]。肝动脉灌 注化疗由于具有较明显的药动学优势,常作为肝癌化疗的常 用手段[3-4] o原发性肝癌(HCC)是典型的富血供恶性肿瘤, 它的发生、发展和转移时刻离不开肿瘤新生血管。肿瘤血管 生成是HCC生长和转移的先决条件,如果肿瘤组织没有新生 血管支持,则因凋亡和坏死而肿瘤不会大于1〜2mm[5]。而 肝癌预后则与癌组织的血管生成调节因子水平和微血管密 度(MVD)密切相关[6-7] o VEGF目前被认为是体内 最强的一种血管生成因子,其在肝细胞癌中呈高表达,与肿 瘤的生长和预后紧密相关[8-10] o肿瘤微血管密度和VEGF 的表达水平直接关联,提示VEGF使肿瘤血管生成会导致肝 癌的浸润、生长转移和复发。5-FU经多年临床应用显示毒副 作用较小的对肝癌细胞敏感性较好的药物,是肝癌化疗目前 最常用的药物之一 [11T2]。本实验以5-FU作为化疗代表药 物进行研究,结果显示两个化疗组VEGF表达均明显低于对 照组(P0.05)。提示肝动脉灌注化疗可以有效降低肝癌组织 的血管密度,而经外周静脉注射化疗则对降低肝细胞癌肿瘤 微血管密度,抑制肿瘤血管生成效果不显著。综上所述,肝 动脉灌注化疗能有效抑制肝癌组织VEGF表达,降低肿瘤MVD, 从而抑制肿瘤血管生成。 参考文献 [1] 郑惊雷,梁力建,胡文杰,等.区域性灌注化疗时5-FU 的血液和肝脏组织药物浓度分布特征[J].南方医科大学学 报,2008, 28 (5): 823-827. [2] Cagol P P, Pasqual E, Bacchetti S.Potential advantages of loco-regional intra-arterial chemotherapy[J]. In Vivo, 2006, 20 (6A): 777-779. [3] Nitta H, Beppu T, Imai K, et al. Adjuvant hepatic arterial infusion chemotherapy after hepatic resection of hepatocellular carcinoma with macroscopic vascular invasion:!]. World J Surg, 2013, 37 (5): 1034-1042. [4] Giunchedi P , Maestri M , Gavini E , et al. Transarterial chemoembolization of hepatocellular carcinoma-agents and drugs : an over