肝动脉灌注化疗抑制肝癌血管生成探究

肝动脉灌注化疗抑制肝癌血管生成探究 【摘要】目的通过对肝癌大鼠进行肝动脉区域灌 注化疗，研究其对肿瘤血管生成的影响。方法建立大鼠肝 癌模型后，将造模2周后的肝内荷瘤大鼠18只，按照随机 数字表法分为对照组、外周静脉组和肝动脉组各6只。大鼠 的5-FU给药剂量为20 mg/kg,连续给药4 do化疗结束后 第7天摘取肝脏肿瘤，采用免疫组化法检测VEGF和CD34在 肝癌组织中的表达。通过VEGF蛋白染色测定积分光密度 I0D, CD34标记血管内皮细胞检测肿瘤内微血管密度 MVD o结果对照组VEGF表达I0D值为 46351.48 2926. 24 ,明显高于外周静脉组 43678. 84 2852. 76和肝动脉组35518. 862657. 16, 且肝动脉组的肝癌VEGF表达明显低于外周静脉组，差异均 有统计学意义P0. 05。结论肝动脉灌注化疗能有效抑制 肝癌组织VEGF表达，降低MVD,从而抑制肿瘤血管生成。 【关键词】肝癌；肝动脉灌注化疗；血管生成；血 管内皮生长因子；微血管密度 肝动脉灌注化疗是肝癌常用的区域灌注化疗方法，目前 常作为肝癌术后治疗和不能切除的晚期肝癌治疗的重要手 段。既往的研究提示经肝动脉区域灌注化疗可显著提高肝脏 组织药物浓度，同时达到减少药物在外周血和全身其他部位 分布［1］。化疗药物抑制肿瘤血管生成是抗肿瘤的重要机制, 本文以5-Fu为化疗代表药物，通过对肝癌大鼠进行肝动脉 区域灌注化疗，研究其对肿瘤血管生成的影响，现报告如下。 1材料与方法 1. 1试剂与药品兔抗鼠CD34多克隆抗体，VEGF多克隆 抗体，武汉博士德有限公司生产。DAB显色试剂盒，SP即用 型试剂盒，PBS缓冲液，福州迈新有限公司生产。5-FU由南 通精华制药公司提供，批号070402,规格10 mL 0.25 g。 1.2肿瘤细胞株和实验动物CBRH-7919大鼠肝癌细胞 株，中山大学细胞保藏中心提供。（l）BALB/c雄性裸鼠2只， 17. 1〜19. 6 g重，作种鼠皮下接种肿瘤细胞。（2） Wistar 雄性大鼠18只，（12015） g重，作肝内种植肿瘤用。上述 动物均为SPF（无特定病原）级，由中山大学动物中心提供。 1. 3方法 1.3.1大鼠肝癌模型的建立 将培养好的大鼠肝癌细胞 注射于裸小鼠背部皮下，2周后成瘤并取出，切成1 mmXl mmXl mm瘤块。然后采用肝内隧道植入法将瘤块接种于 Wistar大鼠肝左叶。手术当天始腹腔注射氢化可的松2 mg/ 只/dX5 do术后密切观察造模后荷瘤大鼠的生物学行为、 死亡情况等。 1.3.2实验分组及给药造模2周后，将18只荷瘤大鼠 按照随机数字表法分为对照组（不作任何处理）、外周静脉 组（经尾静脉注射）、肝动脉组（经胃十二指肠动脉插管至 肝动脉给药），6只/组。大鼠的5-FU给药剂量为20 mg/kg, 连续给药4 do 1. 3. 3标本采集和处理化疗结束后第7天处死大鼠摘 除肝脏肿瘤组织，并置于10福尔马林中固定后石蜡包埋。 将瘤体石蜡标本块切片，厚度约5 umo脱蜡后通过微波加 热法修复抗原，予免疫组织化学染色。每例标本取2张切片, 滴加CD34抗体和VEGF多抗各1滴。 1. 3. 4 VEGF检测 标本经染色封片后在显微镜下（X200） 观察，细胞浆显示棕黄色颗粒为VEGF阳性细胞。每张切片 选阳性表达最高的5个高倍视野（X400）照相，采用IPP图 像分析软件将VEGF蛋白染色的黄色区域作为AOI （area of interest）测定分析光密度。取5个视野的积分光密度（I0D） 平均值作为该标本的表达强度计量值。 1. 3. 5 MVD检测 参照Weidner的标准计算各组肿瘤内的 微血管密度（MVD）低倍镜下（X100）寻找切片中棕黄染 色密度最高的区域，即为富含血管组织的“热点”区。再在 高倍镜下（X400）按染色为棕黄色的内皮细胞均记为一条 独立血管的标准计算血管数目。每张切片分别选10个不同 高倍视野计算MVD,取平均值。 1.4统计学处理采用SPSS 13.0软件对所得数据进行 统计分析，计量资料用（x土s）表示，比较采用t检验，以 PO. O5）o 3讨论 区域灌注化疗可以增加癌灶和靶组织器官的化疗药物 浓度和/或降低外周血及其他组织的药物分布，是目前实体 肿瘤化疗增效减毒的重要措施和手段之一 [1-2]。肝动脉灌 注化疗由于具有较明显的药动学优势，常作为肝癌化疗的常 用手段[3-4] o原发性肝癌（HCC）是典型的富血供恶性肿瘤， 它的发生、发展和转移时刻离不开肿瘤新生血管。肿瘤血管 生成是HCC生长和转移的先决条件，如果肿瘤组织没有新生 血管支持，则因凋亡和坏死而肿瘤不会大于1〜2mm[5]。而 肝癌预后则与癌组织的血管生成调节因子水平和微血管密 度（MVD）密切相关[6-7] o VEGF目前被认为是体内 最强的一种血管生成因子，其在肝细胞癌中呈高表达，与肿 瘤的生长和预后紧密相关[8-10] o肿瘤微血管密度和VEGF 的表达水平直接关联，提示VEGF使肿瘤血管生成会导致肝 癌的浸润、生长转移和复发。5-FU经多年临床应用显示毒副 作用较小的对肝癌细胞敏感性较好的药物，是肝癌化疗目前 最常用的药物之一 [11T2]。本实验以5-FU作为化疗代表药 物进行研究，结果显示两个化疗组VEGF表达均明显低于对 照组（P0.05）。提示肝动脉灌注化疗可以有效降低肝癌组织 的血管密度，而经外周静脉注射化疗则对降低肝细胞癌肿瘤 微血管密度，抑制肿瘤血管生成效果不显著。综上所述，肝 动脉灌注化疗能有效抑制肝癌组织VEGF表达，降低肿瘤MVD, 从而抑制肿瘤血管生成。 参考文献 [1] 郑惊雷，梁力建，胡文杰，等.区域性灌注化疗时5-FU 的血液和肝脏组织药物浓度分布特征[J].南方医科大学学 报，2008, 28 5 823-827. [2] Cagol P P, Pasqual E, Bacchetti S.Potential advantages of loco-regional intra-arterial chemotherapy[J]. In Vivo, 2006, 20 6A 777-779. [3] Nitta H, Beppu T, Imai K, et al. Adjuvant hepatic arterial infusion chemotherapy after hepatic resection of hepatocellular carcinoma with macroscopic vascular invasion]. World J Surg, 2013, 37 5 1034-1042. [4] Giunchedi P , Maestri M , Gavini E , et al. Transarterial chemoembolization of hepatocellular carcinoma-agents and drugs an over