OGDCE2和BCOADAE2的二联体检测在原发性胆汁性肝硬化中的意义
OGDC E2和BCOADA E2的二联体检测在 原发性胆汁性肝硬化中的意义 作者:陈燕,娄加陶,姚定康,周晔,吴传勇,钱玲, 蒋天舒,陈波,仲人前,邓安梅 【摘要】 目的通过重组表达抗原OGDC E2和BCOADC E2的二联体融合蛋白(B0),并用于检测自身抗体及临床 意义。方法重组表达的融合蛋白(B0),通过Ni NTA亲和 柱纯化,经过免疫印迹法(IBT)和酶链免疫吸附(ELISA)法检 测56份PBC患者血清,以48份自身免疫病患者、50份其他 肝病患者、70例正常人血清为对照组。结果56例确诊的PB C患者中,42例阳性,阳性率为75. 0%o而健康体检者和疾 病对照组血清中的M2抗体均为阴性。结论通过用重组表达 的二连体B0检测PBC患者血清中的M2抗体,具有一定的特 异性及敏感性,为临床进一步研究PBC,辅助诊断提供一些 辅助参考。 【关键词】BCOA DA E2 OGDC E2二联体(B 0); 免疫印迹;酶联免疫吸附试验;原发性胆汁性肝硬化 原发性胆汁性肝硬化(primarybi 1 iarycir rhosis, PBC) 是以进行性胆汁淤积伴有肝损伤为特点,并逐渐形成肝硬化 及其并发症。其肝组织病变特征是以淋巴细胞为主的大量炎 性细胞浸润,肝内小叶间胆管的慢性非化脓性破坏性胆管 炎,最终发展为肝硬化甚至肝功能不全。血清线粒体抗体 M2 (AMA M2)诊断PBC的敏感性和特异性均超过90%~9 5%, 为本病最突出的免疫学指标异常,也是重要的诊断手段[1]。 M2抗体的靶抗原主要为线粒体上的2 氧酸脱氢酶复合体(2 OADC)的其中一些组分:侧链二氧酸脱氢酶复合体E2(BCO ADC E2)、丙酮酸脱氢酶复合体E 2 (PDC E2)、2 氧戊 二酸脱氢酶(OGDC) [2~3]。我们通过采用重组抗原(BCOADC E2)和2 氧戊二酸脱氢酶(OGDC)的复合体B0来检测M2抗体, 以利于PBC的早期诊断。 1材料和方法 1. 1标本来源 PBC患者组56例,为本院XX年8月—XX年6月间,经 住院检查确诊的PBC患者。其中女54例,男3例,男女比 例为1: 18o年龄32~6 5岁。并且PBC的诊断符合2000年美 国肝脏病学会(AASLD)推荐的诊断指南:排除甲、乙、丙、 戊、庚型病毒性肝炎;肝功能异常,有胆汁淤积的生化改变 (主要是碱性磷酸酶、Y 谷胺酰转肽酶升高)且无其他原因 解释;血清抗线粒体抗体或M2抗体阳性,同时AMAN1:4O[4]。 患者并行穿刺病理检查,汇管区有大量淋巴细胞、嗜酸粒细 胞聚集,光镜下可见小叶结构完整,实质内可见凋亡小体形 成及散在点状坏死,均符合PBC早期病理学特征。70例正常 对照均为本院的健康体检者,50例其他肝病患者和自身免疫 病患者48例(类风湿性关节炎15例,系统性红斑狼疮20例, 强直性脊柱炎3例,自身免疫性胆管炎10例)为疾病对照组, 均为本院住院患者。 1. 2纯化重组抗原 将特异性扩增OGDC E2和BCOADC E 2的二联体 BOcDNA定向插入高效表达载体PET28a(+),转导入宿主菌大 肠埃希菌(E. coli). BL2 1,经异丙基硫代 B D半乳糖 昔(I PTG)诱导后表达,在变性条件下用带6个组氨酸的Ni NTA琼脂糖纯化,获得高纯度的重组B0,方法参见文献[5]。 1. 3利用重组融合抗原IB T检测M2抗体 将重组蛋白B0经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)电 泳后,转印至硝酸纤维素(NC)膜,封闭后依次加入血清、辣 根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG,显色剂3. 3 二氨 基联苯胺四盐酸盐底物和H2 02,观察反应条带。同时用正 常人血清作阴性对照。 1. 4 ELISA法检测M2抗体 ELISA方法检测PBC患者,健康体检者和疾病对照组血 清中的M2抗体。纯化后的重组蛋白,用碳酸盐缓冲液 CBS (pH9. 5)稀释后分别包被酶标板。0P为4mg/L, 4C过夜 (16h),吐温-20碳酸盐缓冲液洗涤3次后,加入小牛血清封 闭,洗涤后依次加入待检血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗 人IgG、显色剂3. 3 二氨基联苯胺和H202,经酶标比色 仪吸光度450nm比色,读取吸光度值,判定值为阴性对照A 值+5倍标准差。 1 5统计学处理 用StlJderlt s检验分析均值间差异。第2期 陈 燕, 等 2结果 2. 1免疫印迹检测结果 用重组融合抗原B0经IB T检测,56例确诊的PBC阳性 病人,检测出抗B0抗体阳性的为42例,阴性14例。正常对 照和其他非胆汁性肝硬化患者抗B0抗体均为阴性。48例自 身免疫病患者中,10位自身免疫性胆管炎患者中2例AMA阳 性;但其血清中抗B0抗体均为阴性。结果见表1。表1抗 B 0抗体与AMA抗体检测结果(略) 2 2常规方法检测 采用常规方法检测,自身免疫病患者和其他肝病患者、 健康对照者中M2抗体均为阴性。而56例确诊的PBC患者中, 其M2抗体为阳性42例,阴性14例;与我们采用的IB T法 和ELISA法检测结果完全符合。 23 ELISA法检测抗B0血清 用ELISA法检测时,正常对照组值为(89 + 35)U,因此 以>289U(±5s)为阳性标准,3 讨论 原发性胆汁性肝硬化(PBC)的特征是血中线粒体抗体为 阳性,而高滴度的抗线粒体抗体(AMA)是PBC的重要血清学指 标。根据其靶抗原不同,AMA可分为M1~M9共9个亚型,其 中M2对PBC的诊断最具特异性。PBC在任何年龄段均可发 病,其中90%~95%为女性,大部分集中在30〜70岁之间,儿 童少见⑹。 AMA对PBC具有诊断意义。95%~98%的患者AMA阳性,因 此抗体出现可早于临床表现多年,所以具有早期诊断价值。 近年来研究显示,M2亚型对PBC具有较高的特异性和诊断价 值。PBC的发病率在我国鲜见报道,近年来国外报道PBC也 呈上升趋势。 1987年以来鉴定出M2靶抗原为线粒体上的2 氧酸脱 氢酶复合体(2 0ADC)的一些组分:丙酮酸脱氢酶(PDC)、2 氧酸脱氢酶(BCO ADC)、2 氧戊二酸脱氢酶(OGD C)等, BC0ADC和0GDC的抗原表位位于内酯酰区。在PBC患者血清 中0GDC的阳性率为39%~88%,而BC0ADC的阳性率为53%~55% [4~7]o 我们采用重组表达的BCOADC E2和OGDC E2的二联 体B0,作为靶抗原来检测PBC患者血清中的M2抗体。56例 PBC患者检查出B0抗体阳性42例,阴性的12例,其阳性 率为75. 0%0自身免疫病患者、其他肝病患者和健康体检者 血清中均未检测出B0抗体。 通过早期检测M2抗体,有助于早期确诊PBC患者,对指 导治疗有一定参考价值。 【参考文献】 \[1\]王芸,范红,郭强.原发性胆汁性肝硬化与抗线 粒体抗体M2检测的临床意义中华现代内科学杂 志,XX, 2 (3): 21 1-222. \[2\]VandeWaterJ,GersbwonME, L eungP,etal. Theauto epitopeofthe