2A肽载体
2A肽及其在多基因共表达中的应用 摘要:2A肽( 2A peptide)最初于1991年在口蹄疫病毒(FMDV)中鉴定得到,2A肽平均长度为18~22氨基酸,是一种可以自裂解为小片段肽,为小RNA病毒属小核糖核酸病毒。2A 肽是近年运用较多的一种构建多基因载体的工具,2A肽,与其它多基因构建策略相比,2A 肽序列较短,且可以等摩尔表达,剪切效率高可达85%-95%。本文就2A及类2A肽的起源、作用机制、蛋白亚定位的关系以及应用方面做一综述。 关键词: 2A肽 ; 多基因载体 Abstract 2A peptide (2A peptide) was originally in 1991 by foot and mouth disease virus (FMDV) get identified, the average length of 2A peptide 18 to 22 amino acids, is a small fragment can be cleaved from a peptide, a small RNA virus. 2A peptide is used in recent years to build a multi-gene vector tools, 2A peptides, compared to other multi-gene construct, have the shorter sequence, and can express equimolar shear high efficiency up to 85% - 95%. In this paper, we do a review on the relationship between the origin 2A, the mechanism of action, protein localization and sub-applications. Key words:2A peptide; Multicistronic vectors 在转基因动物的构建过程中,为便利目标基因的检测,常须要以绿色荧光蛋白( GFP)、红色荧光蛋白(Cherry)、黄色荧光蛋白(YFP)等示踪基因与目标基因同时分别表达,这就须要一个介导多个基因同时胜利表达载体构建技术。基于这一目的,一些探讨策略已得到应用: (1)双向或多启动子分别单独启动多个基因表达; (2)单一启动子启动多个基因以融合蛋白形式表达; (3)多个质粒共转染及多病毒载体共感染; (4)在不同基因之间插入内部核糖体结合位点(internal ribosomal entry sites,IRES) ; (5)在不同基因开放阅读框中间插入蛋白酶剪切位点[1]。 近来应用较多的多基因表达载体是IRES,因为IRES表达的是非偶联的蛋白,克服了融合表达活性低的缺点,并且IRES构建表达载体能进行蛋白定位的。然而,IRES含500个核苷酸,在容量有限制的载体上就限制极大,一般只能构建双基因表达载体无法实现真正意义上的多基因表达载体。同时,由于IRES作用机制使得其连接的上下游蛋白表达状况极不平衡。下游蛋白表达量只有上游蛋白的 10% ~50% [2]。此外,IRES会对其他表达蛋白的活性产生较大影响。以上 这些因素限制了IRES策略在多基因载体构建中的大量运用。 2A肽属于cis-水解酶作用元件(CHYSEls),最初在口蹄疫病毒(FMDV)中发觉,2A肽平均长度为18~22氨基酸[3]。2A肽可在蛋白翻译时通过核糖体跳动从自身最终2个氨基酸C末端断裂。甘氨酸和脯氨酸之间的肽链结合群在2A位点是受损的,能引发核糖体跳动而从第2个密码子起先翻译,从而使1个转录单元里2个蛋白独立表达[4]。这种2A介导的剪切广泛存在于全部的真核动物细胞当中。因此,2A肽序列短小且前后基因表达均一的优点可胜利解决IRES功能上的局限性。利用2A肽较高的剪切效率及促使上下游基因平衡表达的实力,可以改进异源多聚蛋白(如细胞表面受体、细胞因子、免疫球蛋白等)的表达效率。本文概述2A及类2A肽的起源、作用机制、蛋白亚定位的关系以及在探讨中应用。 1 2A肽的起源 2A肽于1991年在口蹄疫病毒(FMDV)中发觉,是一种可以自裂解为小片段肽,属于小RNA病毒,平均长度为18~22氨基酸[3]。在FMDV中,它可以通过核糖体跳动将自己的C-端自动裂解,同时N-端被3C/3CD蛋白酶裂解[3]。再后来的探讨中发觉,其他小RNA病毒属诸如心病毒、马鼻病毒属(E2A)、猪肠病毒(P2A)、微小核糖核酸病毒和某些parechoviruses中也发觉有类似的2A肽序列,并且发觉这些2A肽均有裂解活性[5]。活性类2A肽序列也分别在克氏锥和T.brucei L1Tc非LTR逆转座子开放阅读框的N末端检测到近来在紫色海胆中也发觉了肽片段,并且具有活性。另外,2A肽出现在某些非LTR逆元件像(锥体虫)和核酸结合寡聚体区域(NOD)样N-末端、或者Caterpiller蛋白中[6]。因此,这种限制蛋白生物发生的序列不仅出现在病毒,而且出现在与逆元件病毒相关的基因插入序列中。 2A肽和类2A肽序列在真核细胞中也存在活性,从酵母到到哺乳动物。以2A肽为基础的裂解唯一的必需条件是须要80S核糖体翻译。其它2A肽序列也已在探讨中被运用,包括马鼻炎病毒,猪圆环病毒,2A肽属于cis-水解酶作用元件(CHYSEls)[7]。CHYSEL序列由两部分组成:一段AA非保守序列和一段带有保守序列-D(V/I)EXNPGP的强α螺旋特性的序列。翻译过程中,核糖体会跳过CHYSEL序列中甘氨酸和脯氨酸之间的肽键,终止蛋白合成,并起先下一个蛋白的翻译合成[8]。 2 常见的2A肽及类2A肽序列 虽然2A肽的调整机制在大部分真核细胞中普遍存在,但在原核细胞中尚未发觉。目前,有四个2A肽序列在生物医学探讨中应用较广泛,它们分别是:FMDV 2A(F2A)、马鼻炎病毒A病毒2A(E2A)、猪圆环病毒-1 2A(P2A)和Thoseaasigna virus 2A(T2A)(图1)。前三个都属于小RNA病毒,第四个属于昆虫病毒[9]。 FMDV属小核糖核酸病毒,是一种单链RNA病毒ssRNA,其mRNA约由8500个核酸组成,一个单独的长开放读码框含有2332个密码子,编码一个259KD的多聚蛋白。FMDV 2A RNA序列在全部口蹄疫病毒中均高度保守[5]。 图1 已在生物体内胜利应用的2A肽序列。这些序列功能已在体内外探讨中被胜利验证。口蹄疫病毒(FMDV);马鼻炎A病毒(ERAV) ;猪圆环病毒-1(PTV1);Thosea asignavirus (Tav)。 加粗为各2A肽序列的保守区,箭头为裂解位点。 3 2A肽的作用机制 对2A肽介导的多蛋白表达在探讨早期运用无细胞翻译系统(兔红细胞裂解物,小麦胚芽提取物)分析2A肽调整的裂解反应时,发觉2A肽的裂解机制不是蛋白酶酶解作用的结果[10]。 探讨表明肠病毒和鼻病毒主要的裂解活性是由一个病毒编码的约17KD