HILIC色谱柱介绍

创作时间：二零二一年六月三十日 之南宫帮珍创作 创作时间：二零二一年六月三十日 亲水作用色谱（HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一 .本文 简介了 HILIC 的起源、界说、分离特点；比力了 HILIC 和反相色 谱（RPLC）的选择特性, 讨论了 HILIC 与质谱联用技术的特点 , 并对其使用中的注意事项进行了总结 .1. HILIC 的概念亲水色谱 （HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保管较差的强极性物质保 管行为的色谱技术.它通过采纳强极性固定性, 而且结合高比例有 机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的 .而这样的流动相 组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度 .2. HILIC 的分离机制 HILIC 的分离机理在目前还存在着争议, 主要 包括以下三个方面：（ 1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶 极相互作用.更多的试验现象则标明 HILIC 的保管机理包括氢键作 用、偶极作用和静电作用等多种次级效应, 很难将其区分开来. 3.HILIC 影响保管的主要因素普遍认为 HILIC 保管行为受到多种 参数的影响, 如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱 温、流动相缓冲体系的 pH 值、缓冲盐的种类和浓度.影响样 品在固定相上的保管行为的最主要因素都是流动相中有机相的比 例, 例如乙腈的含量的增加会显著增加样品的保管因子.在 HILIC 分离模式中, 溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃丙酮乙腈异 丙醇乙醇甲醇水, 流动相中水是最强的洗脱溶剂 .一般采纳乙 腈-水体系作为流动相 , 其中水相的比例为 5%-40%以保证其显著 创作时间：二零二一年六月三十日 创作时间：二零二一年六月三十日 的亲水作用.如图 1 所示, 将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙 醇取代, 随着流动相极性的减小, 待测物在柱上的保管就会增强. Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid. 4. HILIC 与 RP-HPLC 的比力传统的反相色谱（RPLC）对强极性和 亲水性的小分子物质的保管和分离能力较弱 , 通常流动相需要采 纳高比例的水相才华实现其保管 , 然而高比例的水相会招致一系 列问题, 比如固定相的反浸润和 ESI-MS 灵敏度的下降.HILIC 正 好可以解决这些问题, 它提供了一种与传统 RPLC 互补的保管方式, 能够使在 RPLC 上保管较弱或没有保管的物质在 HILIC 柱上提供合 适的保管, 如图 2 所示： Figure2:Chromatogramscomparingtheretentionof allantoinonAtlantisHILICSilicaandAtlantisdC18 columns. (a) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis dC18; mobile phase: 10 mM ammonium ate, pH 3; Shows no retention (k =0) of allantoin. (b) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis HILIC Silica; mobile phase: 95:5 (v/v)acetonitrile–watercontaining10mMammonium ate, pH 3; Shows retention (k =1) of allantoin. 另外, HILIC 柱上的洗脱顺序与 RPLC 柱上的正好相反, 极性较小 创作时间：二零二一年六月三十日 创作时间：二零二一年六月三十日 的物质先出峰, 极性较年夜的物质后出峰.如图 3 所示： Figure 3. Comparison of ESI+MS response using HILIC and RP conditions. SIR channels of acetylcholine (m/z 146.2) and choline (m/z 103.9); Columns: 100 mm×2.1 mm, 1.7μm (A) ACQUITY UPLC BEHC18(B)ACQUITYUPLCBEHHILIC.Peaks:1= acetylcholine, 2 = choline 5.HILIC 与质谱技术联用HILIC 可为强极性和强亲水性的化 合物提供合适的保管.通过优化多个色谱参数, 有利于实现目标组 分和基质中干扰物质的分离 , 从而降低基质效应的影响；而含有 高比例水溶性有机相的流动相又有利于提高质谱离子化效率 , 进 而提高质谱分析的灵敏度 .质谱响应在某种水平上是取决于 流动相中有机相的比例.采纳 ESI 源时, 毛细管中离子化的过程类 似于一个电泳过程.由于毛细管被加高压, 形成带电液滴.溶剂蒸 发, 离子向液滴概况移动 , 当液滴概况电荷发生的库仑排斥力与 创作时间：二零二一年六月三十日 创作时间：二零二一年六月三十日 液滴概况的张力年夜致相等时 , 液滴会分裂成更小的液滴 , 对半 径10nm 的液滴, 液滴概况形成的电场足够强 , 电荷的排斥作用 最终招致部份离子从液滴概况蒸发出来, 形成了气相离子.而有机 相的概况张力比水相的概况张力小很多 .因此, 在相同的条件下, 流动相中有机相的比例越高, 质谱的响应越高.从图 4 可以看出, 在 HILIC 柱 上 的 响 应 比 在 RPLC 柱 上 的 响 应 高 出 十 倍 左 右. Figure 4. Chromatograms comparing the retention and MS responseofanalyteonC18mInertsilODS-3; mobilecolumn and HILIC column. (A) Column: 2.1×50mm, 3 phase: methanol-water containing 0.2% ic acid (15:85, v/v) (B) Column: m ACQUITY UPLC BEH HILIC; mobile phase: methanol-watercontaining2.1×50mm,1.70.2%ic acid (85:15, v/v) 创作时间：二零二一年六月三十日 创作时间：二零二一年六月三十日 6. HILIC 柱的使用（1）初度使用 HILIC 柱时, 应采纳 50 倍柱体 积的乙腈-水（50:50）平衡, 在进第一针前, 应用初始流动相平 衡 20 倍的柱体积.（2）HILIC 柱冲柱子时, 采纳的是乙腈-水 （50:50）来洗去极性物质.如果解决不了问题, 可以使用乙腈-水 (5:95) 来冲柱子.长时间不用时, 将柱子保管在乙腈-水(95