设计RT-PCR引物方法

设计设计 RT-PCRRT-PCR 引物方法引物方法 要鉴定某一个基因在 mRNA 水平上的表达，需要使用Q-PCR 的方法。引物 设计是很重要的一环，要进行 Q-PCR 时，获得引物的途径有很多种，其中最为 方便的是使用 NCBI 和 primer bank， 首先介绍这一方法：比如你要检测某药物对 小鼠细胞中 IL-2 的表达影响，通过 Q-PCR 检测，要设计引物。 ① 登陆 NCBI，选择 gene，在选框中输入 IL-2 mus（搜索小鼠 IL-2 基因） 点击搜索 获得结果如下： 选择第一个基因，打开，可以获得 gene 的 ID 利用 primer bank 和 ncbi 的 gene ID 就可以获得前人已经设计好的引物 ②登陆 primer bank （http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/） ，按下图选 择 NCBI gene ID 选择物种 mouse ，在 for text 中输入前面获得的你要 检测基因的 ID（NCBI 的编号） 点击 查询，获得如下结果 可以看到其它人设计的好几对引物，基本上是通过实验验证的，做 Q-PCR 的话直接拿来用就行了， 点击绿色高亮的链接可以看到其他人使用这对引物 做 Q-PCR 获得的结果。 二、自己设计 Q-PCR 引物方法 比如要检测 CXCR3 的表达，做 Q-PCR 的扩增目的条带在 100bp 左右，如 果半定量的话（通过跑胶定量）扩增产物一般 400bp 左右 ① 登陆 NCBI， 选择 gene， 在选框中输入 CXCR3 mus （搜索小鼠 CXCR3 基因）点击搜索 点击打开 将网页往下拖到 NCBI reference sequence 选择箭头所示 mRNA 序列 打开链接 往网页下方拖动，可以看到 CDS，点击 CDS（编码蛋白区） 出现如下界面，高亮部分为 CDS 去 ATG起始密码子 TAA终止密码子 复制CDS区及其附近部分序列， 如果要提取基因的话需要完全包括CDS区， 如果只是检测的话，比如半定量的话就没必要全部包括。 打开 primer 5 软件，新建一个 DNA 序列 将复制的序列粘贴到选项框中，点击 oK 序列就导入了 primer 5 中，然后单击箭头所指 primer，进入引物设计界面 界面如下，点击 search，使用 primer 自动寻找引物功能 进入界面后，分别按下图选取所需要的参数，PCR product size 使用默认值 即可，primer length 一般在 20bp 左右比较合适 点击 OK 后进入如下界面，点击 OK 出现如下界面，点击 rating，按打分排列，打分是 100 分制，分值越高引物 越好，根据自己试验目的，选择打分高的，产物片段 400bp 左右的引物对， 并且 Tm 温度最好在 60 以上，有义链和反义链 Tm 值靠的越近越好，最好 不要超过 2 摄氏度，下图中Tm 行中蓝色字体表示有义链的 Tm 值，红色字 体表示反义链 Tm 值，PCR 退火温度一般设置比 Tm 值低 5 摄氏度。 我选择的是排行第四的引物对，单击选择后在，引物设计窗口，我们可以看 到这对引物的具体情况，下图中红色箭头指的 S 和 A 分别指的是有义链和 反义链，点击 edit primers 可以复制编辑引物 选择引物序列，复制到 word 文档中作为正向引物 点击 ok 后回到 primer 界面后点击 A，然后点击 Edit primers 获得反向引物 序列 下面是我获得的引物序列 因为做半定量的模板是整个小鼠基因组，这就需要使用 primer-blast 验证引 物的特异性（是否不会扩增出其它的基因） 进入 primer-blast 网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 在 primer parameters 中输入前面设计的正向引物和反向引物 在 primer pair specificity checking 中选择 database 为 refseq mRNA ， organism 中输入 mouse 后选择 mouse 最后选择如下，选择在新窗口中显示结果，点击 get primer。 最后出现如下结果，反馈的结果中就只有一个基因CXCR3，就是我要检 测的基因，证明这对引物的特异性不错，可以用于实验。 并不是选择的每一对引物通过 blast 后就只有一个基因，很多情况下回出现 不是只有一个基因的情况，情况如下图，那就需要再次设计，然后检验，直 到获得特异的结果。 获得特异性结果后，可以使用 oligo7 对所设计的引物进行评价，另外使用 primer5的设计的引物在很多情况下总是特异性不是很好， 也可以使用oligo7 设计引物，oligo7 设计的引物特异性会好一些。 使用使用 oligo 7oligo 7 设计引物设计引物 新建一个序列新建一个序列 将 mRNA 的序列粘贴到新建对话框中，选择 accept&close 选择 search for primers& probes 分别单击 paremeters 和 ranges 在 parameters 中根据图所示选择引物长度（一般在 20bp 左右） 在 ranges 中选择 PCR 产物的长度范围和设计引物的范围 单击 search 后出现引物对选择 selected oligonucleotides 单击选择评分最高的引物 ，然后选择 edit 中 forward primer 和 reverse primer，复 制所设计引物到进入primer-blast网站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行特异性检验 选择 analysis 中的 PCR，查看引物的最适退火温度 另外设计 RT-PCR 引物最好跨内含子，设计方法如下 问题一：如何在 pubmed 上找到目标基因的 DNA 序列以及其内含子和外显子情况。 步骤： 打开 NCBI 主页面，选 GENE，输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因 （fig.1）-》找到你要的种属，打开 -》显示基因信息，找到 ”Genomic regions, transcripts, and products”,点击基因名称， links到geneback （fig.2） -》 显示了该基因DNA的信息(fig.3), 可以看到这是基因组 DNA,从 mRNA 选项中可以看到 JION 后面的是外显子的位置， 该 基因一个共有 3 个内含子，4 个外显子，以及外显子的起至位置，为了以后的操作，可 以把这个 DNA 序列和外显子的起至位置记下来。 使用 oligo 7 设计引物时，在search primer 中，正向引物 search 范围选择在跨内含子区 域，然后寻找合适的引物