荧光机理

1 1 光致电子转移光致电子转移(PET)(PET) 递给荧光基团的键合基团(RecePtor)，负责光吸收并产生荧光发 射信号的荧光基团(Fluorophorc)—其荧光发射强度反映键合基团的结 合状态，以及连接键合集团和荧光基团的连接基团(Spacer)。键合基 团和荧光基团通常为电子给体或者电子受体。 光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后， 激发态的电 子给体与电子受体之间发生电子转移从而导致荧光的淬灭过程。例 如，当荧光分子传感器的键合基团是电子给体， 荧光基团是电子受体 时，具体 PET 作过程如下:在光激发下，具有电子给予能力的键合基 团能够将其处于最高能级的电子转入激发态下荧光基团空出的电子 轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁巨}到原基态轨道发射荧光， 从而导致荧光的淬灭;当键合基团与底物结合后，降低了键合基团的 给电子能力，抑制了 PET 过程，荧光基团中被光激发的电子可以直 接跃迁回到原基态轨道，从而增强了的荧光基团的荧光发射。 因此在 未结合底物前，传感器分子表现为荧光淬灭， 一旦键合基团与底物相 结合，荧光基团就会发射荧光(见图) 由于与客底物结合前后的荧光强度差别很大， 呈现明显的 “关” 、 “开” 状态，因此这类荧光化学传感器又被称为荧光分子开关。 PET 荧光分 子传感器的作用机制可由前线轨道理论“来进一步说明(见图 1.5)。 2 2 分子内电荷转移分子内电荷转移(ICT)(ICT) ICT 荧光化学传感器由推电子基团、 吸电子基团通过 p 电子体系连接 而成，在基态时表现为极化结构，一端为缺电子部分，另一端为富电 子部分;而在光激发下，偶极矩增大，强化了这种极化特征，容易发 生 ICT 过程(如图)。 ICT 荧光化学传感器的工作原理有两种(见图 l.7a):当底物是缺电子基 团(阳离子)时，一种是底物与吸电子基团结合，将增大分子内电荷转 移程度，导致荧光光谱红移;一种是底物与推电子基团结合，则使原 来向共扼体系转移的孤对电子用于与阳离子形成配位键，导致ICT 推一拉电子的特征下降， 导致荧光光谱蓝移。 当底物是富电子基团(阴 离子)时，情况相反。一般情况下，ICT 荧光化学传感器对荧光强度 的影响不如 PET 荧光化学传感器显著。典型例子是同时含有吸电子 取代基、推电子取代基的电子体系，如氨基邻苯二甲酞亚胺、二苯基 烯、氟代香豆素等。 ICT 荧光化学传感器的缺点是对外部环境的变化 十分敏感，有较强的溶剂化效应。 在 ICT 中，有一种情况被称为扭曲的分子内电荷转移(TICT twisted Intramolecular charge transfer)。在具有推一拉电子共扼体系的荧光分 子中，如果推电子基 (如二甲氨基)通过可旋转的单键与荧光团相连 接，当荧光团被光子激发时，由于强烈的分子内光致电荷转移，导致 原来与芳环共平面的电子给体绕单键旋转， 而与芳环平面处于正交状 态，原来的共辘系统被破坏，部分电荷转移变为完全的电子转移，形 成 TICT 激发态(见图)。当形成 TICT 激发态时，原有的 ICT 荧光则 被淬灭。TICT 态常常不发射荧光或者发射弱的长波荧光，少数情况 下会出现 ICT 与 TICT 双重荧光现象。 3 3 荧光共振能量转移荧光共振能量转移(FRET)(FRET) FRET 荧光传感器分子的组成与其他类型传感器有所不同，除了含有 键合基团(Reccptor)彩!连接基团(Spacer)， 还含有两个负责光吸收井产 生荧光发射信号荧光基团(FluoroPhore)，而这两个荧光基团一个是能 量给体(Energy donor，D)，另一个是能量受体(Energy acceptor，A)。 荧光共振能量转移是指在一定波长的光激发下， 荧光基团中的能量给 体(D) 产生荧光发射，并通过偶极一偶极之间的相互作用把能量无辐 射地转移给其附近的处于基态的能量受体(A)荧光基团的过程。FRET 过程的发生与很多因素如光谱重叠的程度、 跃迁偶极的相对方向，给 体(D)和受体(A)之间的距离等有关。首先，能量给体 (D)的发射光谱 与能量受体(A)的吸收光谱有明显的重叠，能量受体必须能够在能量 给体的发射波长处吸收能量， 但能量受体可以是荧光发射基团， 也可 以是荧光淬灭基团。对于前一种情形，激发能量给体时，可以观察到 能量受体的荧光发射;而后一种情形，只能观察到能量给体的荧光变 化。其次，能量给体与能量受体相隔的距离必须远大于它们之间的碰 撞直径(有时甚至相距远达 70-100Å)时，才可能发生能量给体与能量 受体的非辐射能量转移， 又称为长距离能量转移。 另外， 能量给体(D) 与能量受体(A)还必须以适当的方式排列。利用 FRET 效率对距离的 强的依赖性，FRET 广泛应用于蛋白质和核酸的结构及动力学研究、 分子结合的测定等领域。 例如，当荧光分子传感器的两个荧光基团都是荧光发射基团时， 具体 FRET 工作过程如下(见图 1.8):在光激发下， 荧光基团中的能量给体(D) 产生荧光发射;传感器分子通过键合基团键合底物来调节能量给体(D) 和能量受体(A)之间的距离以及排列方向。如果底物的加入使这些因 素均在适当范围，能量给体(D)可将能量通过非辐射转移给能量受体 (A)，表现为能量受体(A)的荧光发射;如果底物的加入使这些因素与 FRET 因素不能匹配，则会抑制 FRET 过程，则表现为能量给体(D) 的荧光发射(图)。 4 4 激基缔激基缔/ /复合物复合物(imer/exciplex)(imer/exciplex) 基于激基缔/复合物(excimer/exciplex)的荧光化学传感器分子的 特点是在一个分子中含有两个荧光基团，如多环芳烃萘、蒽和芘等， 并且两个基团处于分子的合适位置。 当两个荧光基团相同时，其中一 个荧光基团(单体)被激发后，会和另一个处于基态的荧光基团形成分 子内激基缔合物(excimer)。 激基缔合物的荧光发射光谱取代了单体的 发射峰，呈现出一个新的强而宽的、长波长的、无精细结构的荧光发 射峰。当两个荧光基团不同时，则称之为激基复合物(exciplex)。激基 缔/复合物形成与否的关键是两个荧光基团之间的距离， 只有激发态 分子与基态分子之间的距离约为 3.5Å 时，才能形成激基缔/复合物。 基于激基缔/复合物(excimer/exciplex)的荧光化学传感器就是利 用受体结合底物后导致激基缔/复合物构型的形成或破坏，使激基缔/ 复合物的荧光增强或消失，通过单体、激基缔 /复合物的荧光光谱变 化表达底物识别的信息。因此，构型的变化是此类信息产生的原因， 图给出了加入底物后可以形成激基缔合物的荧光化学传感器的工作 原理。萘、芘、蒽等荧光团由于具有较长的激发单线态寿命，容易形 成激基缔/复合物，常常被用于此类荧光化学传感器中。 杂原子对荧光的影响比较复杂，有时增强荧光，有时减弱荧光。主要 看杂原子化合物的结构。简单杂环化合物的荧光量子产率很小， 几乎 为 0，但当他们与苯环相并后的产物荧光大大增强。含氮杂环化合物 的分子中含有 N 原子。在非极性介质中它们的荧光很弱，随着介质 极性的提高，