液体乳中黄曲霉毒素M1的快速检测胶体金免疫层析法KJ201709

附件 3 液体乳中黄曲霉毒素 M 1 的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201709） 1范围 本方法规定了牛奶、 羊奶、 牦牛奶等液体乳中黄曲霉毒素M1的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳中黄曲霉毒素M1的快速测定。 2原理 本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的黄曲霉毒素 M1与胶体金标记的特异性抗体结合， 抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线 （T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。 通 过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中黄曲霉毒素M1进行定性判定。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 3.1试剂 甲醇。 3.2参考物质 黄曲霉毒素M1参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1， 纯度≥90%。 表 1 黄曲霉毒素M1参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量 中文名称 黄曲霉毒素 M1 注：或等同可溯源物质。 英文名称 Aflatoxin M1 CAS登录号 6795-23-9 分子式 C17H12O7 相对分子质量 328.27 3.3标准溶液的配制 3.3.1黄曲霉毒素 M1标准储备液（100 μg/mL）：精密称取适量黄曲霉毒素M1标准品（3.2）， 置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 μg/mL 的黄曲霉 毒素 M1标准储备液；或可直接购买黄曲霉毒素 M1标准储备液。-20℃避光保存备用，有效期 3 个月。 —1—— 3.3.2黄曲霉毒素 M1标准中间液 （100 ng/mL） ： 精密量取黄曲霉毒素M1标准储备液 （100 μg/mL） （3.3.1）0.1 mL，置于 100 mL 容量瓶中，用甲醇 （3.1）稀释至刻度， 摇匀， 制成浓度为 100 ng/mL 的黄曲霉毒素 M1标准中间液。临用新制。 3.4材料 黄曲霉毒素 M1胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为液体乳。 3.4.1金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。 3.4.2试纸条或检测卡。 4仪器和设备 4.1移液器：100 µL、200 µL 和 500 µL。 4.2涡旋混合器。 4.3电子天平：感量为 0.01 g。 4.4环境条件：温度 15—35℃，湿度≤80%。 5分析步骤 5.1试样制备 取适量有代表性样品充分混匀。 5.2试样提取和净化 以液体乳为基质的样品可直接上样检测或根据产品说明书稀释后检测。 5.3测定步骤 5.3.1试纸条与金标微孔测定步骤 吸取100—200 μL样品待测液于金标微孔 （3.4.1） 中， 抽吸5—10次使混合均匀， 不要有气泡， 室温温育3—5min（根据配套说明书进行避光操作），将检测试纸条（ 3.4.2）样品端垂直向下插入 金标微孔中，温育5—10min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。 5.3.2检测卡与金标微孔测定步骤 吸取100—200 μL样品待测液于金标微孔 （3.4.1） 中， 抽吸5—10次使混合均匀， 不要有气泡， 室温温育3—5 min （根据配套说明书进行避光操作） ， 将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡 （3.4.2） 上的加样孔中，温育5—10 min，进行结果判定。 5.4质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 5.4.1空白试验 称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 5.4.2加标质控试验 —2— 准确称取空白试样100 g（精确至0.01g）置于100 mL玻璃溶液瓶中，加入500 μL黄曲霉毒素 M1标准中间液（100 ng/mL）（3.3.2），使试样黄曲霉毒素M1含量浓度为0.5 μg/kg，按照5.2和5.3 步骤与样品同法操作。 6结果判定要求 通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视结果判读如图1。 6.1无效 控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。 6.2阳性结果 6.2.1消线法 检测线（T 线）不显色，控制线（ C 线）显色，表明样品中黄曲霉毒素M1含量高于方法检测 限，判定为阳性。 6.2.2比色法 检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅或几乎不显色，表明样品中黄曲霉毒素 M1含量高 于方法检测限，判定为阳性。 6.3阴性结果 6.3.1消线法 检测线（T线） 、控制线（C线）均显色，表明样品中黄曲霉毒素M1含量低于方法检测限，判 定为阴性。 6.3.2比色法 检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相 当，表明样品中黄曲霉毒素M1含量低于方法检测限，判定为阴性。 手持端 C 线 T 线 消线法 阴性 C 线 T 线 C 线 T 线 阴性 加样孔 样品端 阳性 C 线 T 线 阳性 比色法 试纸条 检测装置示意图 试纸卡 C 线 T 线 结果无效 —3—— 图1试纸条/检测卡目视判定示意图 6.4质控试验要求 空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。 7结论 黄曲霉毒素M1与其他几种黄曲霉毒素（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M2、黄曲霉毒素G1、黄曲 霉毒素G2）有交叉，当检测结果为阳性时，应对黄曲霉毒素M1结果进行确证。 8性能指标 8.1检测限：0.5 μg/kg。 8.2灵敏度：灵敏度应≥99% 8.3特异性：特异性应≥90%。 8.4假阴性率：假阴性率应≤1%。 8.5假阳性率：假阳性率应≤10%。 注：性能指标计算方法参见附录 B。 9其他 本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做 限定。方法使用者应使用经过验证的满足本方法规定的各项性能指标的试剂、试剂盒。 本方法参比标准为 《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定》（GB 5009.24—2016） 。 本方法使用试剂盒可能与黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2存在 交叉反应，当结果判定为阳性时，应采用实验室仪器方法《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素 M族的测定》（GB5009.24—2016）对黄曲霉毒素M1结果进行确证。 —4— 附录 A 快速检测方法性能指标计算表 表 A.1 性能指标计算方法 检测结果检测结果b b 样品情况样品情况a a 阳性阳性 阳性 阴性 总数 显著性差异（χ2） 灵敏度（p+，%） 特异性（p-，%） 假阴性率（pf-，%） 假阳性率（pf+，%） 相对准确度，%c N11 N21 N.1=N11+N21 阴性阴性 N12 N22 N.2=N12+N22 N.1+N.2 χ2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21） ，自由度（df）=1 p+=N11/N1. p-=N22/N2. pf-=N12/N1.=100-灵敏度 pf+=N21/N2.=100-特异性 （N11+N22）/(N1.+N2.) N1.=N11+N12 N2.=N21+N22 N=N1.+N2.或 总数总数 注： a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果； b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。 N：