1蛋白质分离技术

课题课题 3 3 蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离 教材预览教材预览 导言导言 思考思考 1 1：：分离生物大分子的基本思路是什么？ 提示：提示：选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 思考思考 2 2：：蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 提示：提示：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶 解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 思考思考 3 3：： 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？ 提示：提示：变性、变性、空间结构变性、变性、空间结构 思考思考 4 4：：人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 提示：提示：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA 的提取，人的红细胞无细胞 核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白 问题探讨问题探讨 1. 与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义? 提示：提示：哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状， 没有细胞核和细胞器。 其含有的 血红蛋白是有色蛋白， 因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱 液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 2. 电泳的作用及其原理。 提示：提示：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物大分子， 如 氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH 下会带 上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。 电泳技术就是在电场的作用下， 利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、 形 状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度， 从而达到对样品进行分离、 鉴定或提纯 的目的。 本节聚焦本节聚焦 本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离， 使学生能够体验从复杂体系中提取生 物大分子的基本过程和方法， 并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理， 为今后 学习运用这些技术打下基础。 学习过程学习过程 蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、 吸附 性质和对其他分子的亲和力，等等， 可以用来分离不同种类的蛋白质。在本课题中，我们将 学习蛋白质分离方法中的凝胶色谱法。 一、基础知识：一、基础知识： （一）（一）凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法） ：： 1、概念：根据被分离蛋白质的（） ，利用具有网状结构的凝胶的分 子筛作用，来分离蛋白质的有效方法。 2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的 蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（） ，移动速度（） ，而 （）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 （）移动，路程（） ，移动速度（） ，相对 1 分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 3、具体过程： （1）（2）（3）（4）（5） 相对分子质量 较小的蛋白质 相对分子质量 较大的蛋白质 A B A. 的 蛋 白 质 由于 作 用 进 入 凝 胶 颗 粒 内 部 而 被 滞留； 的 蛋 白 质 被 排 阻 在 凝 胶 颗 粒 外面，在了 里 之 间 迅 速通过。 B.（1）混合物上柱； （2）洗脱开始，的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内； 的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外； （3）的蛋白质被滞留；的蛋白质被向下移动。 （4）不同的蛋白质分子完全分开； （5）的蛋白质行程较短， 已从中洗脱出来，的 蛋白质还在行进中。 （二）（二） 缓冲溶液：缓冲溶液： 1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液 PH 发 生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 2、作用： 能够抵制 （） 的对溶液的 （） 的影响，维持 PH 基本不变。 3、缓冲溶液的配制 通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以 制得（）使用的缓冲液。 思考：思考：说出人体血液中缓冲对？ 思考：思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？ 提示：提示：使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH 环境，保证血红蛋白 的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性） （三）电泳：（三）电泳： 1、 概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2、原理：许多 重要的生物大分子，如（）等都具 有 () 在()下，这些基团会带上 （）。 在电场 的作用下， 这些带电分子会向着 与其 （） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 （）以及分 子本身（） 、 （）的不同使带电分子产生不同的 ， 从而实现样品 带电性质、分子大小和形 （） 加入待分离 状的不同，使分子迁移速 中各种分子的分离。 3、分类： 的样品 琼脂糖凝胶电泳 阳极 聚丙稀酰胺凝胶电泳。 测定（测定（ 蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量 ）通常用十）通常用十 2 分子向阳极移动缓冲液 凝胶电泳原理示意图 二烷基硫酸钠（二烷基硫酸钠（SDSSDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳。）—聚丙稀酰胺凝胶电泳。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。SDS 能使蛋白质发生完 全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在 SDS 的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的 结果只是()。SDS 能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS 复合 物，SDS 所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间 的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。 【疑难点拨】【疑难点拨】 1 1．．凝胶色谱法分离蛋白质的原理 凝胶色谱法也称为分配色谱法， 它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。 所用的 凝胶实际上是一些微小的多孔球体， 这些小球体大多数是由多糖类化合物构成， 小球体内部 有许多贯穿的通道， 当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时， 各分子在色谱柱内进行两 种不同的运动， 即垂直向下的运动和无规则的扩散运动， 相对分子质量较大的蛋白质分子不 能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间， 通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质 量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此， 样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出， 相对分子质量中等的分子后流出， 相对分子质量 最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。 此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对 分子质量大的分子通过这种网状结构上的空袭时阻力大， 而相对分子质量小的分子通过时阻 力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。 2．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义 哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状， 没有细胞核和细胞器。 其含有的血红蛋 白是有色蛋白， 因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。 这 使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 3．电泳的作用及其原理 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物大分子， 如氨基酸、 多肽、蛋