酶促反应动力学试验

酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验 ———————————————————————————————— 作者: ———————————————————————————————— 日期： 酶动力学综合实验酶动力学综合实验 实验（一实验（一) )——碱性磷酸酶——碱性磷酸酶 KmKm值的测定值的测定 【目的要求】 1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响 ２.了解米氏方程、Km 值的物理意义及双倒数作图求 Km 值的方法。 【实验原理】 1、碱性磷酸酶: 碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中 ,其中以肝脏为最多。其次为肾脏、 骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性 磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。 2、米氏方程: Michaeliｓ－Menｔｅｎ 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时， 导出了 酶促反应动力学的基本公式,即： (１） 式中：v 表示酶促反应速度, 表示酶促反应最大速度， [S]表示底物浓度， ３、 表示米氏常数。 值的测定主要采用图解法,有以下四种： ①双曲线作图法（图１-1，ａ） 根据公式（１)，以ｖ对[s］作图，此时 1/2时的底物浓度[s］值即为 Km 值, 以克分子浓度(M）表示。这种方法实际上很少采用,因为在实验条件下的底物浓 度很难使酶达到饱和。实测一个近似值，因而１/２不精确。此外由于 v 对[S］的关系呈双曲线,实验数据要求较多,且不易绘制。 ②Lineweaveｒ- Burk 作图法双倒数作图法(图 1-１,b) 实际工作中，常将米氏方程(式（1))作数学变换，使之成为直线形式，测定要方 便、精确得多。其中之一即取(1)式的倒数,变换为Ｌineweaveｒ- Burk 方程式： (2) 以 对作图,即为 y＝ax＋b 形式。此时斜率为，纵截距为。把直线外推 与横轴相交，其截距相交,其截距即为— ③Hｏfsｔｅe 作图法（略） 把(２)式等号两边乘以,得: 。 (3) 以ｖ对作图，这时斜率为,纵截距为,横截距为。 ④Hａnａｓ作图法(略） 把(２）式等号两边乘以[S],得: (4) 以对[s] 作图，这时斜率为，纵截距为。 (a)(b) 本实验主要以双倒数法,即 Liｎｅweaver-Ｂurk 作图法来测定碱性磷酸酶 Kｍ 值。具体原理如下： 本实验以碱性磷酸酶为例,用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯 二钠产生酚和磷酸,在适宜条件下（PH1０．0，和 60℃） ，准确反应 13 分钟。在 碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物,以波长 6２0nm 比色。 在一定条件下色 泽深浅与光密度成正比。反应式如下: 然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度， 即以光密度的倒数作纵坐 标,以底物浓度的倒数作横坐标，按Ｌineweaｖｅr－ Ｂurk 作图法来测定碱性磷 酸酶 Km 值。 【仪器与试剂】 仪器: 1. 恒温水浴 2. 7２１型分光光度计 试剂: 1． 酚试剂：称钨酸钠(W·2O）100g，钼酸钠(Mｏ·2O)25g 置 １5０0mL 磨口回流装置内,加蒸馏水 70０mL,85%磷酸 50mL 和浓硫酸 1０ 0mL。 充分混匀,使其溶解。 小火加热,回流 10h(烧瓶内加小玻璃珠数颗,以防溶 液溢出） ，再加入硫酸锂(ＬiＳO4)１５０ｇ，蒸馏水 50mL 及液溴数滴。在通 风橱中开口煮沸 15miｎ,以除去多余的溴。冷却后定容至 1000ｍL，过滤即成, 此液应为鲜黄色,不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液 使用过久,颜色由黄变绿，可加几滴液溴,煮沸几分钟,恢复原色仍可继续使用。 使用时用蒸馏水稀释一倍,最后酸度为 1N。 2． 2．5ｍM 磷酸苯二钠基质液:称取６25mg 磷酸苯二钠（Ｃ6Ｈ５ＰO4Nａ２• ２H2O),溶于 1,000ml 容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置 冰箱内可保存一年之久。 3． 碱性缓冲液（pH10.0） ： 称取无水碳酸钠 6.36g 及碳酸氢钠 3.36g,溶解于蒸 馏水中，并稀释至 1,0０0ｍl. 4． 碱性磷酸酶液:称取碱性磷酸酶１mg，加水 3~4ml,冰箱内可保存五周左右。 【实验步骤】 取 6 支试管按下表加入试剂： 1２３4５6 2.５mM 磷酸苯0.2０.40.6０.8１.01.0 二钠（ml） 蒸馏水（mｌ)0.８0．6０.4０.2-０.1 碱性缓冲液(ml)１.01．01.０１.0１．01．０ 混匀后,60℃欲温 5 分钟 碱性磷酸酶液0．１0.10.１0.10.1- （ml) 混匀后,６0℃水浴 13 分钟（准确计时） 注意注意：1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确。用移液枪加 2）此时为酶促反应,总体积２．1ml ３)第六管不加酶。 酚试剂(mｌ)1．０１．01.0１.01.0１.０ 10%Nａ3.03．03.0３．03.03.０ 2CO3(ml) 混匀后，室温放置１５分钟 注意注意:1 1)酚试剂为显色剂,同时为酶的变性剂,故加入酚试 剂后酶促反应即停止。 2 2)N Nａａ2CO32CO3 提供碱性环境，加入 Na2CO3Na2CO3 后试剂才显色 以 6 管为调零点,在 62０ｎm 波长处比色。 【结果处理】 1 将各管光密度和底物浓度记入下表 管号O.D1/O.D［Ｓ]1／［S] 1 ２ 3 4 ５ 2 以 1/Ｏ.D 为纵坐标，1／[s]为横坐标，按Liｎeweaｖｅr- Ｂuｒk 作图，求出碱 性磷酸酶的 Km 值。 【注意事项】 １) 加入碱性磷酸酶的量要准确 ２)保温时间要准确 准确保温的方法：从第一管加入酶液开始计时，每隔 1 分钟向下一只试管加酶 液,直至加完,到准确 13 分钟立即向第一管加酚试剂,以终止其反应，并每隔 1 分 钟向下一只试管加酚试剂，直至加完止，这样保证每管准确保温 13 分钟。 【思考题】 1 1） KmKm 的意义及其影响因子 2 2)为什么酶促反应速度以初速度表示 ３） 为什么Ｏ.D 可直接代替 V 作图 4） 分析自己的实验数据 实验（二）——温度对酶活性的影响实验（二）——温度对酶活性的影响 【实验目的】 了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。 【实验原理】 每种酶都有其最适温度,高于或低于此温度酶的活性都降低。 一般而言，若酶 处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失； 而若处于极低温度的环境中只会 使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性。 【仪器与试剂】 仪器： 1．冰箱2．恒温水浴锅3．试管 和试管架 4.吸量管及吸量管架5.移液枪及枪头６.胶头滴管 7.烧杯 试剂: １.PH6．8 的缓冲液：量取 1５.45ml 的 0.2Ｍ磷酸氢二钠和 4.55ml 的柠檬 酸混合摇匀即可。 2.０．5%淀粉的 0.5%氯化钠溶液：0.5g 可溶性淀粉和 0．５ｇ氯化钠，溶 于 1０0ｍl 蒸馏水(需加热)。 3.０．031７５g/L 碘液 4．1Ｍ HＣl 溶液5.1MＮａＯＨ溶液6．稀释 10０倍的唾液７.冰水浴 【实验步骤】 １.制管和预温 由于本实验对恒温反应要求较高,故每个温度梯度使用两支试管，分别标记 为Ａ管和Ｂ管， 同时欲温底物