酶促反应动力学试验

酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验 作者 日期 酶动力学综合实验酶动力学综合实验 实验（一实验（一 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 KmKm值的测定值的测定 【目的要求】 1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响 ２.了解米氏方程、Km 值的物理意义及双倒数作图求 Km 值的方法。 【实验原理】 1、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中 ,其中以肝脏为最多。其次为肾脏、 骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性 磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。 2、米氏方程 Michaeliｓ－Menｔｅｎ 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时， 导出了 酶促反应动力学的基本公式,即 １） 式中v 表示酶促反应速度, 表示酶促反应最大速度， [S]表示底物浓度， ３、 表示米氏常数。 值的测定主要采用图解法,有以下四种 ①双曲线作图法（图１-1，ａ） 根据公式（１，以ｖ对[s］作图，此时 1/2时的底物浓度[s］值即为 Km 值, 以克分子浓度M）表示。这种方法实际上很少采用,因为在实验条件下的底物浓 度很难使酶达到饱和。实测一个近似值，因而１/２不精确。此外由于 v 对[S］的关系呈双曲线,实验数据要求较多,且不易绘制。 ②Lineweaveｒ- Burk 作图法双倒数作图法图 1-１,b 实际工作中，常将米氏方程式（1作数学变换，使之成为直线形式，测定要方 便、精确得多。其中之一即取1式的倒数,变换为Ｌineweaveｒ- Burk 方程式 2 以 对作图,即为 y＝ax＋b 形式。此时斜率为，纵截距为。把直线外推 与横轴相交，其截距相交,其截距即为 ③Hｏfsｔｅe 作图法（略） 把２式等号两边乘以,得 。 3 以ｖ对作图，这时斜率为,纵截距为,横截距为。 ④Hａnａｓ作图法略） 把２）式等号两边乘以[S],得 4 以对[s] 作图，这时斜率为，纵截距为。 ab 本实验主要以双倒数法,即 Liｎｅweaver-Ｂurk 作图法来测定碱性磷酸酶 Kｍ 值。具体原理如下 本实验以碱性磷酸酶为例,用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯 二钠产生酚和磷酸,在适宜条件下（PH1０．0，和 60℃） ，准确反应 13 分钟。在 碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物,以波长 6２0nm 比色。 在一定条件下色 泽深浅与光密度成正比。反应式如下 然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度， 即以光密度的倒数作纵坐 标,以底物浓度的倒数作横坐标，按Ｌineweaｖｅr－ Ｂurk 作图法来测定碱性磷 酸酶 Km 值。 【仪器与试剂】 仪器 1. 恒温水浴 2. 7２１型分光光度计 试剂 1． 酚试剂称钨酸钠W2O）100g，钼酸钠Mｏ2O25g 置 １5０0mL 磨口回流装置内,加蒸馏水 70０mL,85磷酸 50mL 和浓硫酸 1０ 0mL。 充分混匀,使其溶解。 小火加热,回流 10h烧瓶内加小玻璃珠数颗,以防溶 液溢出） ，再加入硫酸锂ＬiＳO4１５０ｇ，蒸馏水 50mL 及液溴数滴。在通 风橱中开口煮沸 15miｎ,以除去多余的溴。冷却后定容至 1000ｍL，过滤即成, 此液应为鲜黄色,不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液 使用过久,颜色由黄变绿，可加几滴液溴,煮沸几分钟,恢复原色仍可继续使用。 使用时用蒸馏水稀释一倍,最后酸度为 1N。 2． 2．5ｍM 磷酸苯二钠基质液称取６25mg 磷酸苯二钠（Ｃ6Ｈ５ＰO4Nａ２ ２H2O,溶于 1,000ml 容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置 冰箱内可保存一年之久。 3． 碱性缓冲液（pH10.0） 称取无水碳酸钠 6.36g 及碳酸氢钠 3.36g,溶解于蒸 馏水中，并稀释至 1,0０0ｍl. 4． 碱性磷酸酶液称取碱性磷酸酶１mg，加水 34ml,冰箱内可保存五周左右。 【实验步骤】 取 6 支试管按下表加入试剂 1２３4５6 2.５mM 磷酸苯0.2０.40.6０.8１.01.0 二钠（ml） 蒸馏水（mｌ0.８0．6０.4０.2-０.1 碱性缓冲液ml１.01．01.０１.0１．01．０ 混匀后,60℃欲温 5 分钟 碱性磷酸酶液0．１0.10.１0.10.1- （ml 混匀后,６0℃水浴 13 分钟（准确计时） 注意注意1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确。用移液枪加 2）此时为酶促反应,总体积２．1ml ３第六管不加酶。 酚试剂mｌ1．０１．01.0１.01.0１.０ 10Nａ3.03．03.0３．03.03.０ 2CO3ml 混匀后，室温放置１５分钟 注意注意1 1酚试剂为显色剂,同时为酶的变性剂,故加入酚试 剂后酶促反应即停止。 2 2N Nａａ2CO32CO3 提供碱性环境，加入 Na2CO3Na2CO3 后试剂才显色 以 6 管为调零点,在 62０ｎm 波长处比色。 【结果处理】 1 将各管光密度和底物浓度记入下表 管号O.D1/O.D［Ｓ]1／［S] 1 ２ 3 4 ５ 2 以 1/Ｏ.D 为纵坐标，1／[s]为横坐标，按Liｎeweaｖｅr- Ｂuｒk 作图，求出碱 性磷酸酶的 Km 值。 【注意事项】 １ 加入碱性磷酸酶的量要准确 ２保温时间要准确 准确保温的方法从第一管加入酶液开始计时，每隔 1 分钟向下一只试管加酶 液,直至加完,到准确 13 分钟立即向第一管加酚试剂,以终止其反应，并每隔 1 分 钟向下一只试管加酚试剂，直至加完止，这样保证每管准确保温 13 分钟。 【思考题】 1 1） KmKm 的意义及其影响因子 2 2为什么酶促反应速度以初速度表示 ３） 为什么Ｏ.D 可直接代替 V 作图 4） 分析自己的实验数据 实验（二）温度对酶活性的影响实验（二）温度对酶活性的影响 【实验目的】 了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。 【实验原理】 每种酶都有其最适温度,高于或低于此温度酶的活性都降低。 一般而言，若酶 处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失； 而若处于极低温度的环境中只会 使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性。 【仪器与试剂】 仪器 1．冰箱2．恒温水浴锅3．试管 和试管架 4.吸量管及吸量管架5.移液枪及枪头６.胶头滴管 7.烧杯 试剂 １.PH6．8 的缓冲液量取 1５.45ml 的 0.2Ｍ磷酸氢二钠和 4.55ml 的柠檬 酸混合摇匀即可。 2.０．5淀粉的 0.5氯化钠溶液0.5g 可溶性淀粉和 0．５ｇ氯化钠，溶 于 1０0ｍl 蒸馏水需加热。 3.０．031７５g/L 碘液 4．1Ｍ HＣl 溶液5.1MＮａＯＨ溶液6．稀释 10０倍的唾液７.冰水浴 【实验步骤】 １.制管和预温 由于本实验对恒温反应要求较高,故每个温度梯度使用两支试管，分别标记 为Ａ管和Ｂ管， 同时欲温底物