胸腔积液脱落细胞端粒酶逆转录酶mRNA检测及其意义【精品论文】

胸腔积液脱落细胞端粒酶逆转录酶mRNA检测及其 意义 作者：小小小 作者：仇铁峰陈萍丁明凌夏金 【摘要】目的：通过检测良、恶性胸腔积液脱落细胞端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因的表达情况，探讨其在良、恶性胸腔积液中的诊断价值。方法： 采用逆转录 多聚酶链反应法检测39例恶性胸腔积液、16例良性胸腔积液中 hTERT基因的表达情况。结果：恶性胸腔积液中hTERT基因的表达率明显高于 良性胸腔积液(P<0. 05) o检测hTERT基因表达对恶性胸腔积液的敏感性、特异 性和诊断符合率分别为87. 18%, 81. 25%和85. 45%。结论：hTERT基因参与了 恶性胸腔积液的发生、发展过程。采用RT PCR法检测胸腔积液中hTERT基因 表达有助于临床上良、恶性胸腔积液的鉴别诊断。 【关键词】胸腔积液；端粒酶逆转录酶；逆转录 多聚酶链反应法 [Abstract] Objective: To investigate the diagnostic significance of the detection of the expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene in benign and malignant pleural effusion. s： Telomerase hTERT gene expression of exfoliated cell in pleural effusion of 16 cases with benign pleural effusion and 39 cases with malignant pleural effusion were measured by RT PCR. Results： Telomerase hTERT gene expression of exfoliated cell in malignant pleural effusion was higher than that in benign pleural effusion(P<0. 05). The sensitivity, specificity and diagnostic accordance rate (%) of hTERT mRNA was 87. 18%, 81. 25% and 85. 45%, respectively. Conclusion： Telomerase hTERT gene might involve in pathological process of malignant pleural effusion. The detection of telomerase hTERT gene by RT PCR is useful to diagnose and distinguish the benign and malignant of pleural effusion. [Key words] pleural effusion； human telomerase reverse transcriptase; RT PCR 许多疾病可伴有胸腔积液。随着肿瘤发病率的上升，恶性胸腔积液也显 著增多。正确判断胸腔积液良、恶性质，对于明确疾病诊断、制定治疗策略和 判断预后都具有重要的临床意义。目前临床诊断恶性胸腔积液的金标准为脱落 细胞学检查，但是细胞学敏感性仅为40%〜60% ［1］，阳性率不能令人满意。 端粒酶(telomerase)被公认为已知分布最广的肿瘤标记物，几乎在所有类型的 肿瘤中均有不同程度的表达，而在大部分正常组织中基本不表达。人端粒酶逆 转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是调节端粒酶活 性的限速决定因子，其表达变化与端粒酶活性密切相关［2］。因此，本研究采 用逆转录 多聚酶链反应（RT PCR）法检测胸腔积液中hTERT mRNA的表达， 探讨其在良、恶性胸腔积液临床鉴别诊断中的价值，以探索一条借助分子生物 学手段提高胸腔积液诊断水平的新途径。 1材料和方法 1. 1材料 55份胸腔积液标本来自55例不同的患者，从江苏大学附属医院2003年2 月〜2007年6月间呼吸科住院和门诊患者中收集。所有标本均在首次胸腔穿刺 的过程中留取。 根据临床最终诊断（脱落细胞学、胸膜活检、淋巴结穿刺和纤维支气管镜检 查等）结果，55例患者分成良、恶性胸腔积液两组。恶性胸腔积液组：39例患 者，男性24例，女性15例，年龄38〜89岁，平均年龄（60±13）岁。其中肺 癌22例，胸膜间皮瘤1例，食管癌2例，肝癌1例，甲状腺癌1例，白血病1 例，卵巢癌1例，不明来源10例。经胸腔积液常规涂片脱落细胞学检查确诊的 有15例。胸腔积液收集前患者均未行化疗和放疗。良性胸腔积液组：16例患 者，男性11例，女性5例，年龄38~89岁，平均年龄（45±17）岁。其中结 核性胸膜炎14例，心功能不全合并胸腔积液2例。 1.2主要试剂和仪器 人肿瘤细胞分离液比重约为1.055 g/ml,购自天津市颇洋生物制品科技有 限责任公司。Trizol试剂、反转录试剂盒和PCR试剂为Invitrogen公司产 品。琼脂糖选用Promega公司产品。主要仪器包括日本SANYO公司MDF 382E 超低温冰箱、上海安亭科学仪器厂TDL S台式低速离心机、上海市离心机械 研究所IL 16R台式高速冷冻离心机、日本HITACHI公司U 2800紫外分光光 度计、美国BI0RAD公司MyCycler PCR仪和全自动凝胶图像分析系统。引物由 上海英骏生物技术有限公司合成。 1.3方法 1.3. 1收集胸腔积液细胞 选取胸腔积液患者，抽取胸腔积液200 ml,加 入枸椽酸钠抗凝，混匀。其中100 ml胸腔积液送病理室进行常规脱落细胞学检 查，剩余的100 ml胸腔积液于4°C条件下离心20 min,收集细胞沉渣用PBS液 混悬后，缓慢加至人肿瘤细胞分离液上，20°CT 2 000 r/min离心20 min。 收集中间层细胞，-70°C保存，用于检测hTERT基因。 1.3.2引物设计 引物用Primer软件自行设计。hTERT基因mRNA引物序 列：上游 5’ AAGTTCGTGGACTGGCTGAT 3’，下游 5’ GCACGACGTAGTCCATGTTC 3’，扩增片段为 294 bp。取 GAPDH 基因为内 参，GAPDH 基因 mRNA 引物序列：上游 5’ ATGACCACAGTCCATGCCAT 3’，下 游 5’ TTCCTCTTGTGCTCTTGCTG 3’，产物长度是 526 bp0 1.3.3细胞总RNA提取 应用Trizol试剂消化细胞，消化后用氯仿抽 提，异丙醇沉淀总RNA,溶于DEPC水中。紫外分光光度仪测定总RNA的含量和 RNA260/280比值。提取的总RAN-70°C冻存备用。 1.3.4 RT PCR操作 取细胞总RNA 2. 0 u g,按反转录