同型对照
同型比照 同型比照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的,而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。还可以用来竞争性的结合抗体,与功能阻断抗体发挥同样的功能。 同型比照要与一抗的来源,Ig分型和标记完全一样。 同型比照(Isotype Control):运用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白,用于消退由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的 背景染色。假如一抗是多抗,可以用an normal serum(与一抗相同的正常血清) (must be the same species as primary antibody)。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以询问试剂商。同型比照为免疫荧光标记中的阴性比照。由于荧光标记单抗的组来源不同,应选用相同来源的未标记单抗作为同型比照来 调整背景染色。举个例子:比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b,clone OX-42 purified IgG,那么它的isotype 是mouse IgG2a, 所以可以用purified(纯化的) mouse IgG2a来做OX-42的同型比照(Isotype Control)。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。 同型比照:是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类,若运用干脆免疫荧光染色法,同型比照也应标记荧光色素,如IgG1 FITC、IgG2a、PE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外,同型比照与MoAb所标记的荧光 色素、浓度、F:P比值(标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值)应当相同为最佳,这对精确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义,切忌运用与MoAb不相 匹配的同型比照,最好为同一试验室、采纳相同工艺或方法制备(犹如一品牌)的产品。 流式同型比照 一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体,比如抗人的CD56 APC标记的抗体,成份是Mouse IgG1,。那么它的同型比照应当是FITC标记的MouseIgG1,。留意同型比照的成份跟它的名称是相同的. (2)假如是抗体的组合形式是纯化的一抗+荧光标记的二抗,那么应当选择一抗的同型比照。比如CD86的纯化抗体,成分是MouseIgG1,。它的同型比照是纯化的Mouse IgG1,。它的二抗PE标记的抗小鼠IgG1,。那么染色方式如下:样本管:纯化的CD86+PE标记的抗Mouse IgG1(二抗)+样本,同型比照管:纯化的同型比照+PE标记的抗MouseIgG1(二抗 )+样本. (3)假如没有找到适合的同型比照,在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下,那么优先选择的依次应当是亚链不同--亚型不同--相同类别。比如,某种的抗体的来源是Mouse IgG2а,。假如在同型比照表里面找到不到完全相同的同型比照,那么优先选择相同荧光标记Mouse IgG2а为同型比照。假如也没有找到Mouse IgG2а,那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2b作为同型比照。假如最终还是没有找到Mouse IgG2b,那么选者相同荧光标记的Mouse IgG2作为同型比照。 3、哪些客户须要运用同型比照? A 对流式不是特别熟识的客户。 B 做胞内流式客户,比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。 C 运用不常见的标记或者特异性不高的标记的客户