1固相析出分离技术

2.1 固相析出分离技术 通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式从溶液中沉降析出的分离纯化技术称为固相析 出分离技术。根据析出物的形态不同分为结晶法（结晶析出）和沉淀法（无定形固体析出） 第一节沉淀分离技术沉淀分离技术沉淀法也称溶解度法，其纯化生物大分子的原理是根据物质的结构差异（如蛋白 质分子表面疏水基团和亲水基团比例的差异）来改变溶液的某些性质（如pH 值、极性、离子强度、金属离 子等） ，使抽提液中有效成份的溶解度发生变化，从而达到从抽提液中分离有效成份的目的。 一、盐析沉淀法 1.盐析的原理定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐 溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出， 这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏， 最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。 盐能够改变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有密切关系。两者的关系可用下式表示： lglg（（S/SoS/So ））= -KsI= -KsI S 为蛋白质在离子强度为 I 时的溶解度(g/L)；So 为蛋白质在离子强度为 0 时的溶解 度；Ks 为盐析常数；I 为离子强度。 在温度一定的条件下，某一蛋白质在某一 pH 值的水溶液中的溶解度为一常数 So。故上式可 改写为：lgSlgS = = lgSolgSo –– KsI = KsI = ββ –– KsI KsIβ =lgSo 为一常数 β 值主要取决于蛋白质的性质，也与溶液的温度和 pH 值有 关 ；盐析常数 Ks 主要与盐的性质(离子价数、平均半径等)和蛋白质的结构有关，Ks 越大， 盐析效果越 好。 所以对某一蛋白质来说，在温度和 pH 值等盐析条件确定(即β 确定)，所采用的盐确定(即 Ks 确定)以后， 蛋白质的溶解度决定于离子强度Ｉ,Ｉ可用下式计算： ＩＩ = 1/2 = 1/2 ∑∑m m i iZ Zi i m m i i: :溶液中离子的摩尔浓度 溶液中离子的摩尔浓度 Z Z i i： ： 离子的价数离子的价数对于多种蛋白质或酶的混合液， 可采用分段盐析法进行分离纯化。 2.盐的选择：蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用 最广的是硫酸铵。 硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分 子的能力也大，成为有效的盐析工具。 硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小( 25℃时溶解度为4.1mo l/L，即 767g/L;0℃时溶解度为 3.7mol/L，即 697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。 但是用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进行盐析。 磷酸钾和硫酸钠的盐析系数 Ks 较大，但由于在较低温度下的溶解度太低,受温度影响大，故应用不广泛。 3.硫酸铵浓度的计算与调整方法 : 通常硫酸铵的添加以百分饱和度來表示 (不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在 80% 硫酸铵饱和度下 沉淀。因为硫酸铵加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比來計算，因此使用百分饱和 度作为沉淀蛋白质的度量。 用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种 ： （1）加入饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高 V= V V= V 0 0(S (S 2 2-S -S 1 1)/ )/（（1-S1-S 2 2） ） V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V 0:原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵 饱和度；S 1:原溶液的硫酸铵饱和度。 饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至 50－60℃，趁热滤去沉淀，再在 0℃ 或室温平衡 1－2 天，有固体析出时达 100％饱和度。 2)加入固体盐法要求：饱和度高，不增大溶液体积 t=G(S t=G(S 2 2-S -S 1 1)/ )/ （（1-AS1-AS 2 2） ） S2， S1:分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度； t： 将 1L S1 饱和度的溶液提高到 S2 饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G,A：常数，与温度有关。 实际使用时，t 可直 接查表得到。 （注意：0℃，25℃两张表，室温用 25℃） 4.影响蛋白质盐析的因素： 2 2 （1）蛋白质浓度 蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来（共沉现象） 。因此在盐析前要加等 量生理盐水稀释，使蛋白质含量在 25－30g/L。 （2）离子强度和离子类型的影响 a.离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生 b.不同蛋白质盐析时所需离子强度不同，可采用分步盐 析，通过逐步增加离子强度，使不同蛋白分步沉淀出来 c.离子强度相同时，高价离子，半径小的离子盐析 力强 3）pH 的影响大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液pH 值调到等电点效 果最好。 （4）温度的影响 a.在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加； b.在高盐溶液中，温度升高，溶 解度降低。 一般在室温下进行盐析;温度敏感的蛋白质在低温 4℃进行;也有个别酶在低温时失活，高温有活性,如血红 蛋白、肌红蛋白、清蛋白在 25℃比 0℃时溶解度低，更容易盐析。 实际使用：制备初期：pH ，温度一定，改变盐浓度 （离子强度） （Ks 分段盐析） ；纯化，结晶：离子强度一定，改变 pH，温 度（β分段盐析） lgS = lgSolgS = lgSo –– KsI = KsI = ββ –– KsI KsI 5.盐析时的注意事项 ： （1）添加的硫酸铵的纯度要高，添加后，要放30min 以上使其充分溶解，且要不断 搅拌，防止局部过浓，发生共沉淀； （2）同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用分段盐析的方法。盐析 通常与等电点沉淀法配合使用。 （3）选择好温度，一般在室温下进行； （4）蛋白浓度不易过高，一般 25－ 30g/L；低浓度盐析，可用离心分离；高浓度盐析（70－80％） ，用过滤（因为粘度大，离心操作慢） ；盐析 沉淀得到的蛋白质含量较高，纯品需经脱盐处理，如透析，凝胶过滤等。 二、有机溶剂沉淀法 （一）作用机理： （1）降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低；（2）破坏大分子周围水膜，使溶解 度降低。 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经 常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。 优点：比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。 缺点： 有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。蛋白质和酶沉淀分离后， 应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。成本较高，有一定的危险性。中性盐可减 少有机溶剂引起的蛋白质变性，提高分离效果，一般添加 0.05mol/L 的中性盐。 由于中性盐会