转基因植物生产疫苗和药物的研发进展

转基因植物生产疫苗和药物的研发进展转基因植物生产疫苗和药物的研发进展 天然来源的药用蛋白往往因提纯成本高而导致价格昂贵， 疫苗和重组蛋白则 需建立人工表达系统来生产。传统的生产方式主要包括细菌、酵母、昆虫或哺乳 动物细胞等系统，但这些方式都有各自的缺点， 如微生物细胞无法对蛋白进行哺 乳动物的糖基化修饰或正确的折叠组装， 动物细胞表达系统成本高且有污染病原 的风险等。理想的蛋白表达系统必须能生产有功能的产物、生产成本低、产物易 于纯化、生产耗时短。近年来，转基因植物表达药用蛋白（Plant-made pharmaceuticals，PMP）的新技术平台获得了广泛关注。 ［1］ 1 1 转基因植物生产疫苗和药物研发概述转基因植物生产疫苗和药物研发概述 与其他几种表达系统相比， 以转基因植物作为生物反应器生产重组蛋白被认 为具有突出优点：方法简单、成本低廉、易于规模化生产、储藏和运输方便等， 既能对表达蛋白进行翻译后折叠和糖基化修饰，与通常使用的哺乳细胞、大肠杆 菌、酵母表达系统相比，又没有污染人类病原或毒素的风险，成为表达药用蛋白 的理想选择。 ［2］ 1986 年研究者将人生长激素基因引入烟草，获得了表达产物，从此开启了 PMP 的研发工作。1989 年研究者首次在烟草中成功表达了人免疫球蛋白G （IgG），证明植物中能够合成并正确组装这种多亚基的糖蛋白。首先实现商业 化生产的PMP 是以色列药品研发公司 Protalix 开发的在胡萝卜细胞中表达的葡 糖脑苷脂酶，于2012 年美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市，用于治疗 β-葡萄糖脑苷脂酶减少或缺乏引起的一种遗传代谢病——高雪氏病（Gaucher’ s disease），其价格要比天然来源的药物更便宜。 在植物可食部分表达疫苗（被称为“可食疫苗”或“口服疫苗”， Edible vaccines）是 PMP 领域的研发热点之一。传统疫苗生产和纯化过程较为复杂和 昂贵，在运输和储存过程中必须冷藏，注射免疫的方式进一步增加了成本，需要 专业人员进行注射接种，存在交叉感染的风险，具有潜在的安全性问题。用转基 因植物生产疫苗则具有可当地种植、常温储藏的天然优势，将免去或部分免去蛋 白纯化的花费，摒弃注射方式，也不存在弱毒疫苗毒性恢复的潜在风险。更为重 要的是， “可食疫苗”食用后可同时引起粘膜免疫反应与血清免疫反应。在消化 道内， 植物细胞壁能够保护疫苗抗原不被消化酶降解，直到肠道微生物降解植物 细胞壁后，抗原被释放出来，引发免疫反应。表达疫苗或药用蛋白的植物细胞在 冻干后可在室温保存多年，是产生黏膜免疫的经济可行的方法。将抗原决定簇蛋 白与穿黏膜载体（如霍乱毒素 B 亚基，CTB；大肠杆菌热不稳定肠毒素 B 亚基， LTB） 融合表达， 重组蛋白能够有效地穿过肠道上皮细胞而进入循环或免疫系统， 可提高抗原运送至免疫系统的效率，促进了口服疫苗的研发。 ［3］ 2 2 几种主要的表达技术系统几种主要的表达技术系统 2.1 转基因植株表达 通过农杆菌介导、 基因枪等方法将外源基因整合入植物细胞核，可使外源重 组蛋白质连续稳定合成。根据信号肽的有无，表达蛋白可以存储在不同的细胞器 内或分泌至胞外。这种表达方式的优点是蛋白质能够进行完整的翻译后修饰，但 外源基因容易受到基因沉默、位置效应 （外源基因的表达因插入位置不同而变化 的现象）等的影响，表达量较低，存在转基因安全性的问题。在目前研发的产品 中，主要受表达量低的因素限制，还没有通过临床一期试验的例子。通过位点特 异性同源重组， 将外源基因插入植物叶绿体基因组中，可使目标蛋白在叶绿体内 积累。 植物细胞中叶绿体基因组的数量可达上万拷贝，这可极大提高外源基因的 表达量。例如，在叶绿体基因组中引入人生长激素基因时，表达量能达到细胞核 转化的百倍以上；通过遗传改造的表达系统， 表达量甚至可高达可溶性蛋白总量 的 72% 。 引入叶绿体基因组的外源基因没有核转基因中经常发生的位置效应， ［4］ 也不会发生基因沉默。在开花前收获植株， 能够防止通过花粉或种子发生转基因 漂移。采用多顺反子表达的策略，用一个启动子能够表达多个外源基因。脊髓灰 质炎、疟疾、肺结核、轮状病毒、猪流感等多种病毒的抗原都在叶绿体中成功获 得了高表达。 ［5］ 2.2 瞬时表达 以农杆菌接种法（Agroinoculation）或农杆菌渗入法（Agroinfiltration） 介导基因瞬时表达是近年来发展起来的表达技术， 是植物遗传转化与植物病毒学 技术的融合。首先构建携带病毒表达载体的农杆菌 T-DNA，通常利用花椰菜花 叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）等作为载体，将重组蛋白基因与病毒衣壳蛋白融合，或用衣壳蛋 白启动子启动重组蛋白基因。通过植物叶片气孔注射或真空渗入的方法，使农杆 菌进入植物叶片细胞间隙，借助农杆菌侵染作用使病毒 DNA 载体有效运输到植 物细胞中。 病毒载体在植物细胞中大量复制， 几天之内就能表达大量的外源蛋白， 最高表达量可达总可溶蛋白的 27.6%。采用农杆菌渗入法瞬时表达可提高表达 量，显著缩短植物处理过程，降低下游成本 ［6，7］。以病毒基因组为框架的表达载 体构建是瞬时表达技术系统的关键。烟草花叶病毒和马铃薯 X 病毒载体能够实 现外源基因的大量表达，但由于是 RNA 病毒，导致同时表达多个蛋白的效率较 低； 双生病毒载体表达系统能够表达较大的外源蛋白；烟草脆裂病毒载体表达系 统适用于基因沉默和在植物根部表达。随着未来研发的深入，将有望创造出融合 不同优点的新的病毒表达载体。 2.3 悬浮细胞表达 将农杆菌转化形成的植株或植物愈伤组织细胞制备成悬浮细胞， 能够较为容 易的在发酵罐中进行扩大生产。2006 年美国农业部批准的第一例禽用新城疫病 毒疫苗就采用了烟草悬浮细胞表达系统。2012 年 FDA 批准的首例人用药用蛋 白——葡糖脑苷脂酶是就在胡萝卜细胞中表达的。 此外， 还在水稻悬浮细胞中获 得了表达量为 5.1 μg/mg 的猪流感病毒 E2 糖蛋白，口服后可引发小鼠和猪的 黏膜免疫与细胞免疫反应。 但以该系统生产的产品仍需经过较为复杂的下游纯化 过程和低温无菌储存运输，其成本相对较高，并没有完全发挥出植物生物反应器 的优越性。 3 3 转基因植物表达疫苗与药用蛋白的代表性研发案例转基因植物表达疫苗与药用蛋白的代表性研发案例 迄今为止，一批重组抗体、抗原、疫苗、医用或药用蛋白都在转基因植物中 获得了表达。除烟草外，生菜、番茄、胡萝卜、大豆、马铃薯、苜蓿、水稻及玉 米等植物常被用作表达系统。 ［8］ 3.1 疫苗 首例植物来源的口服疫苗早在 1995 年即研发成功， 是在烟草和马铃薯中表 达的大肠杆菌热不稳定肠毒素 B 亚基 LTB，饲喂小鼠后能够引起血清 IgG 和分 泌型 IgA 合成。此后，马铃薯块茎表达的诺如病毒衣壳蛋白 VP1、马铃薯和玉 米表达的大肠杆菌毒素疫苗、水稻表达的霍乱疫苗等都进入了临床一期试验，在 被试者体内引发了血清免疫。美国陶氏益农（Dow AgroSciences）公司研发的